如何把circRNA的上游机制做细?

今天给大家分享一篇circRNA的研究Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma(JOURNAL OF HEPATOLOGY),作者来自于东方肝胆医院,通讯作者是周伟平教授。

要确定研究的分子,可以自己做测序,也可以查文献、做生信预测(师兄在讲座中常讲的)。这篇文章采用的策略是,首先做测序,挑上调前8,下调前8的进行PCR验证,最终他们挑选了在肝癌中下调的cSMARCA5作为进一步研究对象,原因有:

1、在肝癌和正常肝组织中cSMARCA5的基因丰度高;

2、cSMARCA5的表达趋势与它对应的mRNA和蛋白相反,预示着其潜在的生物学功能;

3、在2015年的一篇Cell的文章中报道(The RNA Binding Protein Quaking Regulates Formation of circRNAs),cSMARCA5在上皮间质转化(EMT)的过程中起到了重要的作用。

 

circRNA挑好了,但你挑的真的是circRNA么?所以先要验证cSMARCA5确实是一条circRNA。为此作者做了以下验证工作:

1、cSMARCA5没有poly(A)尾巴;

Fig 2C. 在加入Oligo(dT)18引物(Oligo(dT) Primer利用了碱基互补配对的原则以及mRNA含有poly(A)尾巴的特点,使得Oligo(dT)Primer只能和mRNA配对,并在适宜的条件下完成反转录。)之后,cSMARCA5表达显著下调,而mSMARCA5无显著变化。

 

2、cSMARCA5对RNase R的有耐受性

Fig 2D.cSMARCA5对RNase R的耐受性远高于mRNA

 

3、cSMARCA5的半衰期比mRNA的长

Fig 2E.cSMARCA5的半衰期远比mRNA的长

 

之前说到,cSMARCA5的表达趋势与mSMARCA5以及蛋白是相反的,为什么呢?

 

circRNA和mRNA均来自于pre-mRNA,转录后修饰在RNA前体加工为成熟RNA的过程中起到了重要的作用。其中,RNA结合蛋白对于circRNA的产生具有重要的调控作用。根据文献报道,DHX9、ADAR1和QKI这三个RNA结合蛋白的作用最为普遍,在敲减DHX9后,cSMARCA5的表达量显著上调(其它两个没有显著作用)。

 

Fig 3D.敲减DHX9后,cSMARCA5的表达量显著上调,mRNA和pre-mRNA无显著变化。

 

DHX9是RNA核解旋酶,它可以通过结合circRNA侧翼的反向互补序列并抑制这些序列的配对来抑制circRNA的产生。对结合序列进行突变可以逆转DHX9对cSMARCA5的抑制作用。

 

至此,cSMARCA5的上游机制研究基本结束。下游机制则是我们非常熟悉的ceRNA机制了,cSMARCA5通过吸附miR-17-3p和miR-181b-5p调控TIMP3(广泛报道的肿瘤抑制分子),由于肝癌中cSMARCA5下调,相应的miRNA上调,导致TIMP3下调,从而促进HCC增殖和侵袭。

 

分子机制图

 

当然了,一篇12分的文章,动物实验肯定是少不了的,这里也不再赘述了。

 

circRNA的上游机制总结下来可以从这两方面着手:

1、circRNA的产生机制;

2、影响circRNA差异表达的原因(可变剪切、转录后修饰)。

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