痘病毒的转录结构基础:RNA聚合酶复合物与转录延伸、加帽

真核生物含有DNA复制和基因转录的机器,很多病毒依赖于宿主实现复制和转录,因此需要一个短暂的核期确保病毒的繁殖。在真核DNA病毒中,痘病毒科家族是例外,其复制和转录都在细胞质内【1】,这就需要病毒编码因子参与成熟mRNA的产生过程。Vaccinia病毒是痘病毒家族的非致病型,常用于研究细胞质基因表达。研究表明Vaccinia病毒编码多亚单位RNA聚合酶(vRNAP)和一系列相关因子,确保病毒基因的表达。 

vRNAP含有病毒早期基因编码的8个亚单位,根据分子量分别为Rpo147、Rpo132、Rpo35、Rpo30、Rpo22、Rpo19、Rpo147、Rpo18、Rpo7,与Pol II的亚单位有不同程度的同源性【2】。Rpo147、Rpo132与Pol II的RPB1和RPB2在氨基酸上具有20%的相似性。但目前缺乏vRNAP及其复合物的结构学信息。

 

病毒基因表达根据时间顺序分成早期、中期和晚期。感染不久,早期基因被激活,表达编码的蛋白对病毒基因组的表达和复制非常重要。痘病毒中,vRNAP能够根据DNA模版催化合成RNA,但需要其他辅助因子。病毒早期基因的转录需要异二聚体VETF,VETF与转录起始位点上游和下游的早期基因的启动子结合。VETF和Rap94合作介导vRNAP招募到启动子并转变成活跃的延伸过程。转录起始后,当新生RNA长度达到27~31nt时,加帽过程开始。加帽酶(CE)不仅参与加帽过程,而且和vRNAP、VETF、NPH-I共同作用,促进转录终止。

 

痘病毒的转录含有5’帽子和poly-A尾巴,与宿主细胞产生mRNA类似。帽子结构包含一个N7-甲基化鸟苷残基,通过一个反向的5’-5’三磷酸连接加到新产生的转录产物的5’端,加帽过程发生在转录起始后不久。

 

首先,三磷酸酶(triphosphastase,TPase)水解RNA的5’端三磷酸,生成5’端二磷酸;然后,鸟苷转移酶(guanlyltransferase,GTase)催化添加GMP;最后,甲基转移酶(methyltransferase,MTase)对GMP进行甲基化修饰。三种加帽酶(capping enzyme,CE)活性可以由三种不同的酶执行,比如真菌中;也可以由多功能蛋白质编码,如后生动物利用双功能TPase-GTase多肽和TPase执行,而很多病毒使用三功能酶执行。痘病毒的CE是D1、D12亚单位组成的异二聚体,D1是三功能酶,D12结合于D1的MTase结构域,并以变构方式刺激D1的活性【3】。虽然病毒、酵母、哺乳动物CE的结构信息已经被报道,但是在转录时CE如何与RNA底物相互作用目前尚不清楚。

 

近日,来自德国的Utz FischerPatrick Cramer合作在Cell杂志上发表背靠背文章Structural Basis of Poxvirus Transcription: Vaccinia RNA Polymerase ComplexesStructural Basis of Poxvirus Transcription:Transcribing and Capping Vaccinia Complexes分别解析了痘病毒Vaccinia的vRNAP酶的核心及完整结构,以及转录延伸复合物、转录-加帽复合物的结构,揭示了痘病毒RNA合成和共转录修饰的结构基础。

第一篇解析了痘病毒Vaccinia的核心及完整vRNAP酶的结构,分辨率达到2.8Å。核心结构包含了vRNAP的所有核心亚单位,生化实验表明具有催化活性,能够在体外延伸RNA引物,但是在完整的双链病毒启动子控制下不能产生转录活性,证实核心酶需要额外的转录起始因子。而完整vRNAP酶结构包含所有的核心酶亚单位和VTF/CE、NPH-I、VETF-I、VETF-s、E11L、tRNAGln,能够在体外进行早期基因启动子依赖的转录起始、延伸和终止。

 

核心酶结构中,vRNAP的两个较大的亚单位Rpo147和Rpo132在活性中心的两侧形成裂口,亚单位Rpo35、Rpo7在聚合酶的背面形成聚集,与两个较大亚单位相互作用。Rpo147和Rpo22形成两个“颚”构成DNA双链进入裂口的途径。Rpo22和聚合酶外围的Rpo19、Rpo18结合,Rpo18从聚合酶体中微微突出形成一个“柄”,并锚定在聚合酶和Rpo19上,Rpo19则连接Rpo22。Rpo30与Rpo147的“漏斗”结构域附近的N-端相结合。痘病毒特异性转录因子Rap94仅在核心vRNAP结构中可见,其两个结构域(D2和C端结构域)与裂口对面的酶外围结合。核心酶结构中,7/8的亚单位与Pol II的亚单位具有不同程度的结构上同源性,如Rpo147、Rpo132组成聚合酶的主体,与Pol II的Rpb1、Rpb2高度相似,但两者缺少几个区域而且相对较小;Rpo35兼具Pol II中Rpb3、Rpb11两者的特征,含有类Rpb3的N端和类Rpb11的C端,不过缺少锌离子结合模体及Pol II中与Rbp12、Rbp10结合的区域;vRNAP中缺乏类Rbp12的亚单位,由Rpo35的插入螺旋占据其位置;Rpo7与Rpo35相互作用,在结构和位置上都类似Pol II的Rpb10;Rpo22结构上类似Rpb5,Rpo19结构和功能上都与Rpb6具有同源性。

 

然而,Vaccinia vRNAP具有独特的外围特征,其不含有Pol II的表面亚单位Rbp4、Rbp8、Rbp9、Rbp12等,而且与Pol II同源的亚单位也具有不同程度的差异。如Rpo147没有Rpb1的长链重复CTD结构域,具有一个短的C端尾巴,更加灵活;与Rpb2相比,Rpo132缺少几个小区域,包含几个插入,有一个延伸的C端尾巴,包裹在聚合酶周围,穿过亚单位Rpo19,到达Rpo147的尾部。分析显示,vRNAP表面进化出特化特征,有助于与病毒特异性转录因子结合。Rap94是痘病毒特有的转录因子,参与早期病毒基因启动子的识别和转录终止,与vRNAP表面结合。Rap94的D2结构域与Rpo147、Rpo132相互作用,结合到vRNAP“钳子”的顶部;Rap94的CTD结构域位于Rpo132的叶部。即转录因子Rap94横跨vRNAP的裂口。

 

完整的vRNAP酶结构包含核心酶和额外的蛋白因子E11、VTF/CE、NPH-1、VETF、Rap94,两者形成双叶结构。结构解析显示,Rap94是vRNAP核心和额外蛋白因子间作用的桥梁。Rap94的结构域分布在整个复合物上,通过延展的连接区域与各亚单位相互作用。连接域1将Rap94和NTD与D2相连;靠近Rpo18柄状结构的D2中伸出连接域2向Rpo19延伸,穿过Rpo147的C端尾巴结构,沿着聚合酶dock结构域到达vRNAP的后部;裂口的另一侧,连接域3延伸并穿过Rpo132的壁和突起区域,延伸到Rpo147的漏斗螺旋和Rap94的CTD结构域。Rap94的N端与NPH-I的C端作用,两者形成类结构域模块与VTF/CE接触;二聚体E11核心蛋白进一步加深Rap94和NPH-I接触,而Rap94的D2使tRNAGln适应核心vRNAP。此外,RAP94的核心区域类似于Pol II起始因子TFIIB;亚单位Rpo30与Pol II延伸因子TFIIS类似,且Rpo30将其磷酸化的C端尾巴置于活性中心,抑制转录复合物的形成;转录终止因子NPH-I与染色质重塑因子—SNF2家族的INO80—类似;宿主tRNAGln参与完整vRNAP的形成,有利于稳定vRNAP复合物;起始因子VETF锚定在完整的vRNAP聚合酶上。

第二篇解析了Vaccinia vRNAP在形成转录延伸复合物及共转录-加帽复合物的冷冻电镜结构。转录延伸复合物(elongation complex,EC)由vRNAP核心酶和活性中心裂口中核酸组成,核心酶中8个亚单位基本没有变化。第一篇文章表明Rpo30的C端尾巴磷酸化后占据并抑制vRNAP的活性中心,但EC复合物没有病毒转录因子Rap94参与,活性中心裂口由9-bp的DNA-RNA占据。尽管vRNAP的活性位点有部分氨基酸残基与真核细胞RNA聚合酶有差异,但两者的基本机制是保守的。

 

vRNAP的共转录-加帽复合物(co-transcriptional capping complex,CCC)中聚合酶的构象基本与EC复合物中相同,病毒加帽酶与RNA离开聚合酶处位点相结合。病毒加帽酶(capping enzyme,CE)的亚单位D1、D12主要通过Rpo147、Rpo132、Rpo18、Rpo35与vRNAP结合,Rpo147进行变构,像弹簧一般将CE中TP/GT模体拉到聚合酶表面。CE包含2个可以相互移动的模块,一个是亚单位D1的TPase、GTase结构域组成“TP/GT模块”,另一个是D1的MTase结构域和D12亚单位组成“MT/D12模块”。MT/D12模块靠近聚合酶,D12位于RNA较近的位置,确保与转录产物进一步作用。经过模块位置重排,CE的三个活性位点都定位于RNA的附近。进一步解析发现,CE的TPase结构域与RNA 5’端稳定结合,催化5’二磷酸化的形成,随后发生GMP转移及甲基化,甲基化过程需要SAM共因子。此外,结构解析显示,Rap94和核酸的结合是相互排斥的。
总的来说,两篇文章从结构角度详细阐释了痘病毒vRNAP的结构组成及与真核生物Pol II的同源性比较,并揭示了痘病毒中转录起始、延伸和加帽的结构基础,为研究病毒RNA聚合酶的转录周期提供了框架。

 

原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.023
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.024

 

1. Moss, B. (2013). Poxvirus DNA replication.Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a010199.

2. Zimmermann, L., Stephens, A., Nam, S.-Z.,Rau, D., Ku ̈ bler, J., Lozajic, M., Ga- bler, F., So ̈ ding, J., Lupas, A.N.,and Alva, V. (2018). A Completely Reimple- mented MPI Bioinformatics Toolkitwith a New HHpred Server at its Core. J. Mol. Biol. 430, 2237–2243.

3. Kyrieleis, O.J.P., Chang, J., de la Pen ̃ a, M.,Shuman, S., and Cusack, S. (2014). Crystal structure of vaccinia virus mRNAcapping enzyme provides insights into the mechanism and evolution of thecapping apparatus. Structure 22, 452–465.

研究进展

突变型RAS调控细胞巨胞饮过程促进肿瘤生长

2020-1-11 12:28:57

研究进展

非小细胞肺癌线粒体膜电位活体成像

2020-1-11 12:30:04

声明 本网站部分文章源于互联网,出于传递更多信息和学习之目的转载,并不保证内容正确或赞同其观点。
如转载稿涉及失效、版权等问题,请立即联系管理员;我们会予以修改、删除相关文章,请留言反馈
Notice: When your legal rights are being violated, please send an email to: [email protected]
0 条回复 A文章作者 M管理员
    暂无讨论,说说你的看法吧
个人中心
购物车
优惠劵
今日签到
有新私信 私信列表
搜索