季勇教授团队发现MLP蛋白质修饰调控TLR3/RIP3-p65/NLRP3信号通路

心肌肥厚(Myocardial hypertrophy)是多种心血管疾病如高血压、冠心病、心肌梗死、心脏瓣膜病、先天性心脏病等终末期共同的病理生理表现【1】。现有研究已公认病理性心肌肥厚是心力衰竭的前期病变,通过预防与治疗病理性心肌肥厚可以延缓甚至逆转心肌生物学的功能降低,遏制心力衰竭,提高患者生存率和生活质量。

LIM结构域肌蛋白(Muscle lim protein,MLP)特异性定位在横纹肌的骨骼肌与心肌中,它的功能主要其两个锌指结构域有关。在心肌细胞中,MLP蛋白主要定位在细肌丝Z线附近,它可以通过将很多蛋白质铆钉在Z线上来发挥生物学效应,如心肌细胞骨架蛋白α-actinin 、视松蛋白T-cap 、组蛋白去乙酰化酶HDAC4等等【2】。已有文献报道MLP蛋白缺失或者位点突变可能导致扩心病等一系列心血管疾病。

2020年1月,南京医科大学药学院,江苏省心脑血管药物重点实验室主任,季勇教授团队在循环杂志Circulation 上以长文(article)形式,发表了题为S-nitrosylation of muscle LIM protein facilitates myocardial hypertrophy through toll-like receptor 3-mediated receptor-interacting protein kinase 3 and NLRP3 inflammasome activation的研究论文。

 

季勇教授团队首次发现,横纹肌特异性表达的蛋白质MLP半胱氨酸79位点发生巯基亚硝基化修饰后能促进心肌肥厚的进程。发生巯基亚硝基化修饰的MLP能促进其与TLR3和RIP3的结合进而激活下游P65/NLRP3信号通路以及IL-1β的分泌,促进心肌肥厚。本研究首次发现了一种新的能发生巯基亚硝基化修饰的蛋白质参与调控心肌肥厚,同时发现了TLR3/RIP3及下游p65/NLRP3可能成为潜在药物新靶标;证明了利用IL-1β的中和性抗体可缓解压力过负荷引起的心肌肥厚,为临床治疗心肌肥厚提供了更多的可能性。

首先该课题组利用基质辅助电离激光解吸-飞行时间-串联二级质谱法检测小鼠和大鼠心肌肥厚模型心肌组织中可发生巯基亚硝基化修饰(S-nitrosylation,SNO)的蛋白质,两组样本均发现蛋白质MLP的巯基亚硝基化修饰水平明显增高。有文献报道MLP蛋白质在心肌肥厚、扩张型心肌病、心衰中发挥重要作用【3】,MLP缺失会促进心衰的发生,但是在心肌肥厚中MLP总蛋白表达量不变【4】。以上内容提示MLP在心肌肥厚中发挥的重要作用可能并不依赖其蛋白的表达,而是依赖蛋白质翻译后修饰。为了验证这一猜测,作者在不同的心肌肥厚病人临床样本,小鼠大鼠心肌肥厚模型,细胞模型中检测MLP的修饰情况,在不同的心肌肥厚模型中MLP的巯基亚硝基化修饰水平均明显增高。同时明确MLP的修饰位点为半胱氨酸79位点。

下一步研究中,作者利用CRISPR/Cas9技术构建Cys79突变 Knock-in小鼠,在主动脉缩窄术(Transverse aortic constriction,TAC)小鼠压力过负荷心肌肥厚模型中,明确MLP Cys79点突变明显抑制TAC引起的心肌肥厚,保护心功能。作者进一步探究了MLP发生巯基亚硝基化修饰的原因。在心肌肥厚的细胞动物模型中,去巯基亚硝基化修饰的酶-谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)的表达水平明显降低,过表达GSNOR 可以明显抑制MLP巯基亚硝基化修饰水平。

为了研究MLP发生巯基亚硝基化修饰后调控心肌肥厚的下游机制,作者利用串联质谱筛选与MLP结合的蛋白质,发现Toll样受体蛋白3(Toll-like receptor 3,TLR3)可以与MLP结合,同时这种结合作用受到MLP巯基亚硝基化修饰调控。利用TLR3敲除鼠,作者发现TLR3缺失改善TAC诱导的心肌肥厚,发挥保护功能。TLR3是重要的免疫调控因子,对于细胞内炎症反应有重要的调控作用。作者检测TLR3下游经典信号途径,发现MLP发生巯基亚硝基化修饰后能促进其与TLR3和RIP3的结合,激活下游p65/NLRP3信号通路,进而促进IL-1β的活化。最后作者发现IL-1β中和性抗体能缓解TAC诱导的心肌肥厚。

图. MLP的巯基亚硝基化修饰通过促进其与TLR3/RIP3的结合,激活p65/NLRP3信号通路促进心肌肥厚

 

综上所述,发生巯基亚硝基化修饰的MLP能促进其与TLR3和RIP3的结合,激活下游p65NLRP3炎症小体信号通路,其中MLP的关键修饰位点是半胱氨酸C79位点,该位点发生的巯基亚硝基化修饰对心肌肥厚有明显的促进作用,这种修饰受到去巯基亚硝基化修饰酶GSNOR的调控。

该研究论文通讯作者为南京医科大学季勇教授,共同通讯作者为:南京医科大学第一附属医院老年科韩艺副教授、南京医科大学基础医学院病理生理学系谢利平副教授,第一作者为南京医科大学江苏省心脑血管药物重点实验室讲师唐欣博士。

 

季勇教授研究团队

原文链接:
https://ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.119.042336

 

1. Shimizu I and Minamino T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 2016;97:245-262. doi: 10.1016/j.yjmcc.2016.06.001.

2. Zhao JL, Liang SQ, Fu W, Zhu BK, Li SZ, Han H and Qin HY. The LIM domain protein FHL1C interacts with tight junction protein ZO-1 contributing to the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of a breast adenocarcinoma cell line. Gene. 2014;542:182-189. doi: 10.1016/j.gene.2014.03.036.

3. Vafiadaki E, Arvanitis DA and Sanoudou D. Muscle LIM Protein: Master regulator of cardiac and skeletal muscle functions. Gene. 2015;566:1-7. doi: 10.1016/j.gene.2015.04.077.

4. Kuhn C, Frank D, Dierck F, Oehl U, Krebs J, Will R, Lehmann LH, Backs J, Katus HA and Frey N. Cardiac remodeling is not modulated by overexpression of muscle LIM protein (MLP). Basic Res Cardiol. 2012;107:262. doi: 10.1007/s00395-012-0262-8.

作者简介

季勇,医学博士,教授,博士生导师。南京医科大学药学学科带头人。先后主持了科技部、国自然基金委、省级项目10余项(包括科技部国家重点研发计划重点专项、973前期研究专项、国自然重点项目、国自然重大研究计划重点项目、国自然重点国际合作交流项目等多项基金)。研究成果已在Circulation、Circ Res、PNAS、Nat Commun等国际学术期刊发表SCI论文60余篇、累计影响因子300多,获教育部高等学校科学研究优秀成果奖一等奖、江苏省科学技术奖一等奖及中华医学科学技术二等奖各1项,获国家授权专利2项。

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