“糖化”而非“糖基化”修饰—控制肿瘤生长的“红绿灯”

当我们在过马路的时候,路口的交通信号灯会告诉我们:何时可以通过,何时必须停下来。这一准则对于肿瘤细胞来说同样适用,因为肿瘤的生长和增殖过程同样受很多上游信号和蛋白所调控,转录调控因子NRF2就是其中之一。NRF2被报道在肿瘤的发生发展以及化疗抵抗过程中可以调控细胞应激和氧化还原平衡【1】,而它的一个关键调控蛋白KEAP1(与Cul3,CAND1共同形成泛素E3连接酶复合体)也被发现在很多癌症类型存在突变。种种迹象表明:NRF2与癌症关系密切。正是因为如此,人们一直寄希望于通过靶向NRF2来干预肿瘤的进程。
Glycation(糖化反应)是指还原性的单糖,比如核糖、葡萄糖以及6-磷酸葡萄糖以非酶促的形式共价结合到蛋白的氨基酸残基上 (主要是赖氨酸,精氨酸和组氨酸) 形成的一类翻译后修饰,在食品科学领域也被称作美拉德反应 (Maillard reaction) 。而它的去修饰则依赖于果糖胺激酶 (Fructosamine-3-kinase,FN3K) ,通过直接磷酸化修饰到蛋白质上的糖基从而使得其不稳定并最终从蛋白上掉下来【2】值得一提的是,这里提到的糖化修饰(Glycation)与糖基化修饰 (Glycosylation) 是两个完全不同的概念。首先,糖化修饰是由化学性质活泼的还原性单糖自发地与蛋白氨基酸残基的侧链发生共价结合而形成的翻译后修饰,整个过程不需要酶的参与。而糖基化修饰则是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程,这一过程主要发生在内质网和高尔基体,哺乳动物中蛋白质的糖基化类型主要可分为两种:N-糖基化和O-糖基化。
 
目前,对于蛋白质糖基化修饰的研究有很多,然而尽管已经找到一些糖化修饰蛋白 (包括血红蛋白,胰岛素以,白蛋白以及组蛋白)【3,4】,例如,Yael David课题组今年3月份在Nature Communications发文报道了组蛋白糖化修饰对于染色质结构影响以及在疾病中潜在调控作用【5】,但是关于糖化修饰的生理意义依然有很多值得深入挖掘的地方。
近日,来自纪念斯隆·凯特琳癌症中心的Hans-Guido Wendel教授在Cell杂志上发表了题为The Oncogenic Action of NRF2 Depends on De-glycation by Fructosamine-3-Kinase的研究,他们报道了一个新的糖化修饰蛋白NRF2,并且揭示了由FN3K介导的de-glycation调控NFR2蛋白功能的分子机制。
 
 
TCGA数据库显示,大约15%的肝细胞肝癌患者 (HCCs) 体内NRF2是过度激活的。因此,作者利用CRISPR/Cas9方法在移植瘤的小鼠模型中转入过度激活的NRF2突变体以及敲除NRF2的抑制因子Keap1,结果显示肿瘤生长速度与对照组相比显著增加,并且小鼠的生存时间也明显下降。这说明NRF2的确是个促癌的蛋白。为了搞清楚NRF2作用位点,作者通过全基因组筛选 (pan-cancer genome-wide SELECT analysis) 的方式发现,在HCCs与NSCLC两种癌症类型中,NRF2的过度激活与EGFR突变具有很强的相关性。此外,体外实验表明EGFR的配体EGF和TGFα能通过激活MEK信号通路来诱导NRF2的表达。

 

紧接着,为了找到在氧化应激条件下NRF2潜在的激活因子,作者构建了一个CRISPR/Cas9 文库筛选的系统。他们成功找到了几个可能的调控蛋白,其中包括, Ucp2 (调控线粒体代谢) Rasgef1c(Ras-like GTPase)E2f8 (与NRF2和Cul3启动子直接互作的转录调控因子) ,但作者最终将目光锁定在FN3K,一个被报道可以参与去糖化修饰的蛋白激酶。那么接下来的实验顺利成章,作者通过一系列生化实验和质谱学实验证明,NRF2的确可以发生糖化修饰,并找到了其修饰的关键位点。此外,在体内敲低FN3K可以上调NRF2的糖化修饰水平,这说明NRF2的糖化修饰的确受到FN3K调控。那么,糖化修饰如何调控NRF2的蛋白功能呢?

 

作者发现,在KEAP1野生型的HepG2细胞中敲低FN3K使得NRF2蛋白的稳定性显著降低,而在作为对照的KEAP1突变的Huh1细胞中则不受影响,这说明糖化修饰可以调控NRF2的降解。意外的是,作者发现尽管在Huh1细胞中敲低FN3K不会导致NRF2蛋白量的改变,但其功能依然受到影响,即细胞的氧化还原状态发生了变化。通过进一步的实验,作者发现FN3K的缺失会抑制NRF2与它的辅助因子small MAF蛋白的相互作用,从而影响NRF2蛋白的功能。至此,作者得出结论:糖化修饰调控NRF2蛋白的活性是以KEAP1依赖和非依赖两种方式共同存在的。

 

最后,作者对FN3K调控的NRF2 糖化修饰的生理意义进行了探究。作者发现在HCC模型小鼠中敲低FN3K能显著延缓肿瘤的生长,而回补NAC (N-acetyl cysteine) 则可以部分恢复肿瘤的生长,这提示糖化修饰除了影响NRF2介导的氧化还原平衡之外,还会通过作用其他靶点来调控肿瘤的生长。的确,利用质谱手段对肝癌细胞的蛋白质组分析,作者一共找到110个由FN3K调控的糖化修饰的蛋白,其中就包括代谢酶LDHA和LDHC,翻译调控因子eIF4A1,组蛋白H2和H3等,这些都很值得进行更进一步的探究。
 

综上,该研究不仅找到了一个新的糖化修饰底物蛋白NRF2,并阐述了由FN3K介导的NFR2去糖化修饰在肿瘤发生发展所发挥的重要功能。同时这项研究也提示我们:对于NRF2过度激活的癌症患者来说,FN3K或许可以作为一个新的干预靶点。除了NRF2之外,作者还找到了很多其他FN3K调控的糖化修饰的蛋白,使得糖化修饰的重要性大大提升。

 

原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.07.031
1. Bai, X., Chen, Y., Hou, X., Huang, M., and Jin, J. (2016). Emerging role of NRF2 in chemoresistance by regulating drug-metabolizing enzymes and efflux transporters.Drug Metab. Rev. 48, 541–567.
2. Fortpied, J., Maliekal, P., Vertommen, D., and Van Schaftingen, E. (2006).Magnesium-dependent phosphatase-1 is a protein fructosamine-6-phosphatasepotentially involved in glycation repair. J. Biol. Chem. 281, 18378–18385.
3. Wareham, N.J., and Pfister, R. (2010). Diabetes: glycated hemoglobin is a marker of diabetes and CVD risk. Nat. Rev. Cardiol. 7, 367–368.
4. Hunter, S.J., Boyd, A.C., O’Harte, F.P., McKillop, A.M., Wiggam, M.I., Mooney,M.H., McCluskey, J.T., Lindsay, J.R., Ennis, C.N., Gamble, R., et al. (2003).Demonstration of glycated insulin in human diabetic plasma and decreased biological activity assessed by euglycemic-hyperinsulinemic clamp techniquein humans. Diabetes 52, 492–498.
5. Zheng Q, Omans N D, Leicher R, et al.(2019). Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature communications,10(1): 1289.
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