文献解读:泛癌-单基因分析

今天跟大家文献解读的是发表在EBioMedicineIF6.680杂志上的一篇文章,该文章更偏重于实验哦,做实验的小伙伴可以借鉴下哦。

Aberrant expression of embryonic mesendoderm factor MESP1 promotes tumorigenesis

胚胎中胚层因子MESP1的异常表达促进肿瘤发生

中胚层后壁1(MESP1)是中胚层发育的主要调节者,其在成人病理生理中的作用仍然未知。研究进行了全转录组分析(RNA-Seq)和染色质免疫沉淀(ChIP),发现MESP1直接调节涉及多种癌症特征的基因,MESP1高表达和受MESP1调控的基因标志与NSCLC患者预后不良有关。研究表明,MESP1NSCLC中以前未知的谱系生存癌基因,可能在将来成为肺癌的潜在预后标志物和治疗靶标。

一、材料和方法

1.1质粒和定点诱变

小鼠Mesp1 cDNA从in-house RNA库获得,使用Gateway技术克隆到pENTR1a中,然后使用LR反应将Mesp1-pENTR1a转移到tet诱导表达载体-pLIX403中。使用Millipore的定点诱变试剂盒产生小鼠Mesp1和人MESP1EK突变体,使用DharmaconshRNA慢病毒质粒进行shRNA介导的hMESP1敲低。

1.2细胞系细胞培养和转染

培养来自ATCC的人肺癌细胞系(H358A549H1944H1299H460)和BEAS-2B  null MEFp53 null MEF在含有10FBSDMEM培养基中生长,null MEF添加额外添加剂(MEM非必需氨基酸,β-巯基乙醇和庆大霉素),在9%培养箱中培养,使用慢病毒产生MESP1敲低和Mesp1过表达的稳定细胞系。

1.3细胞增殖集落形成和软琼脂集落形成测定

为了研究细胞增殖,将细胞以1000个细胞/孔的速度接种到96孔板中的相应培养基中,使用MTS分析计数。为了在肺癌细胞系中进行集落形成测定,将1000个细胞接种在6孔板中并温育10天,然后将它们固定并用在100%甲醇中制备的0.1%结晶紫染色。为了在MEF中进行集落形成测定,将10,000个细胞接种在10cm培养皿中培养14天,将它们固定并用在100%甲醇中制备的0.1%结晶紫染色。对于软琼脂菌落形成分析,将300,000MEF接种在4毫升DMEM培养基中,该培养基中含有0.35%的低熔点琼脂糖,在6孔板上覆盖1.5毫升的0.7%的低熔点琼脂糖37℃下培养1个月。

1.4患者RNA样本

正常肺、鳞状细胞肺癌和肺腺癌患者的RNA样本来自OriGene Technologies

1.5 RNA分离和qRT-PCR

使用TRIzol试剂分离所有RNA,使用Takyon One-Step试剂盒转化器Euroscript IITakyon Rox SYBR MasterMix dTTP Blue进行第一链cDNA合成和qRT-PCR,使用特定循环条件进行qRT-PCR

1.6染色质免疫沉淀(ChIP)测定

细胞在10 cm培养皿中生长至75-80%融合,在培养基中用1%甲醛固定细胞,通过添加甘氨酸终止固定反应,在含有蛋白酶抑制剂和PMSF的冰冷的PBS中收集细胞。使用ChIP-IT 表达试剂盒进一步处理ChIP颗粒。获得ChIP DNA后,使用引物进行PCR扩增含有E-box结合模体的基因组区域,计算每个基因基因座的富集。

1.7蛋白质印迹和抗体

全细胞裂解物在RIPA缓冲液中分离,然后通过Pierce BCA蛋白测定试剂盒估算蛋白浓度。蛋白样品在4-12Bis-Tris凝胶上进行凝胶电泳,然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜在5%牛奶/ PBST缓冲液中封闭,然后与一抗在4°C下培养过夜。与相应的二抗一起培养后,使用胶片放射成像显影印迹。

1.8免疫组织化学与分析

使用VECTASTAIN Elite ABC试剂盒和DAB检测试剂盒和抗MESP1抗体进行肺癌和前列腺肿瘤阵列(LC2084MNT241aBCN601US Biomax)的免疫组织化学分析(IHC)。将肿瘤阵列在二甲苯中脱蜡,然后在乙醇中再水化。在199°F的微波中于柠檬酸钠缓冲液中进行抗原恢复,然后使用0.3%的过氧化氢水溶液阻断内源性过氧化物酶的活性,使用正常的山羊血清可阻断非特异性结合,然后将阵列在一抗中4°C培养过夜。第二天,在生物素化的二抗体中培养后产生阵列。使用Gills式苏木精将肿瘤阵列复染色,在乙醇中脱水、二甲苯中培养,然后用甘油凝胶固定介质固定。应用从03的评分系统来评估IHC染色,根据阳性细胞的百分比和染色强度确定每个组织的分数。

1.9 GSEA分析差异表达基因

使用分子特征数据库(MSigDB v6.2)进行基因集富集分析(GSEA)。通过调节的Log2倍数变化对所有显著表达的基因进行排序,针对HHallmark基因集进行测试寻找富集。

1.10数据挖掘

为了确定MESP1在各种癌症中的表达,使用cBioportalGEPIATCGAGTEx数据集,进行生存曲线分析的KM图。

1.11动物研究与影像

68周免疫缺陷的NOD-SCID-Gamma小鼠(NSG)右腹进行皮下注射,针对H358A549细胞系注射200μl PBS中的2.5×细胞。对于H358,对照和敲低细胞系均注射5只小鼠,而对于A549,每组分别注射6只小鼠,监测肿瘤大小并计算肿瘤体积。对于H358,在注射后15天获取肿瘤,对A549在注射后38天获取肿瘤并测量单个肿瘤的重量。

二、结果

2.1 肺癌患者中MESP1的表达升高

使用TCGAGTEx数据集检查各种癌症类型相对于其正常组织MESP1转录本的相对表达,MESP1表达在许多癌症中升高(图1a),包括肺腺癌(LUAD)和鳞状细胞癌(LUSC),与正常相比,MESP1表达水平显著升高肺组织(图1b)。通过qRT-PCR分析验证了LUSCLUAD和正常肺组织的患者RNA样品中MESP1的异常表达,在LUAD患者样品以及LUSC患者样品中,MESP1表达显著较高(图1c)。分析各种肺癌细胞系和非恶性支气管上皮细胞系BEAS-2BMESP1的表达,MESP1的表达均明显高于非恶性BEAS-2B(图1d)。通过IHC进一步分析MESP1的失调,大多数LUADLUSC样品显示中等和高水平MESP1蛋白的表达(图1e)。中和高MESP1水平与腺癌和鳞状细胞癌的所有阶段有关,这表明MESP1对于维持恶性表型可能是必不可少的。 

1. MESP1表达与非小细胞肺癌相关

2.2 MESP1调节NSCLC细胞的生长和细胞增殖

为了确定MESP1是否是NSCLC细胞生长所必需的,用靶向MESP1的两个shRNA转导A549H358 NSCLC衍生的细胞。与乱序的shRNA相比,两个shRNA均显著下调了MESP1的表达(图2a)。进行MTS分析以确定MESP1对细胞增殖的影响,MESP1消耗会显著抑制A549H358细胞的细胞活力(图2b)。集落形成分析表明,敲低细胞中形成的菌落数量明显减少,MESP1敲低也显著影响A549H358细胞的生长能力(图2c)。野生型MESP1的瞬时过表达会诱导A549细胞增殖和克隆生长(图2d-f)。结果表明NSCLC细胞与MESP1的表达升高有关,而MESP1下调与细胞增殖和生长优势降低相关。

2. MESP1调节NSCLC细胞的生长和细胞增殖

2.3 MESP1ARF的缺失共同诱导细胞转化

假设ARF的缺失是MESP1致癌转化所必需的,为了验证这一假设,选择在具有ARF基因缺失的细胞中过表达MESP1,然后评估增殖,转化和转录组分析(图3-5)。引入强力霉素诱导的V5标签p19ARF-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的野生型(wt)或EK突变型Mesp1Mesp1在野生型和EK突变型Mesp1转导的ARF-/-MEF中过表达(图3a),wt-Mesp1 ARF-/-MEF的生长速度明显高于EK-mutant-Mesp1或对照ARF-/-MEF的生长速度(图3b),在菌落形成试验中,wt-Mesp1 ARF-/-MEFsEK-mutant-Mesp1或对照ARF-/-MEFs相比,产生了更多的菌落(图3c),这表明Mesp1过表达导致了生长优势。软琼脂菌落形成试验观察到wt-Mesp1 ARF-/-MEFs比对照ARF-/-MEFs形成更多的菌落,而EK突变型Mesp1 ARF-/-MEFs无法形成任何菌落(图3d)。Mesp1的过表达并未在p53无效的MEF中诱导存活,增殖或转化,而p53仍表达ARF。这表明存在ARF的情况下,MESP1的表达会引起“致癌性应激”;当不存在ARF时,MESP1的表达会导致细胞增殖,存活和转化的增加。

 3. MESP1导致ARF null MEF的致癌转化

 

2.4 MESP1驱动基因特征与多种癌症特征相关

通过比较wt-vs. EK-mutant Mesp1 ARF-/- MEFs 确定了差异表达基因(DEGs),获得了表达依赖于wt-Mesp1的基因(图4a),确定了A549细胞中依赖MESP1DEG(图4b),并将这些基因与wt-Mesp1过表达所依赖的DEG重叠,鉴定MESP1的潜在转录靶点(图4c),两组之间共有91个基因(图4cd)。为了测试癌症的富集特征,对MESP1-OE DEGMESP-KD DEG以及91个常见基因进行了GSEA mSigDB分析,三个列表分别显示出富集的类似癌症特征,EMT以及其他特征(如缺氧,TNFa信号转导,糖酵解和雌激素反应)最为富集。

4. MESP1依赖性基因涵盖了癌症的各种特征

 

为了确定MESP1的直接靶标,将MESP1过表达的DEGs上调基因与MESP1敲低DEGs的下调基因相交(图5a),发现24个基因是MESP1的假定直接靶标。由于MESP1-KD细胞显示胰岛素样生长因子结合蛋白4IGFBP4),Serpin家族B成员9SERPBINB9),结缔组织生长因子(CTGF),肌腱蛋白1TNS1),肌肉Ras癌基因同源物(MRAS),中胚层特异性转录本(MEST),Ras同源家族成员URHOU)和Fms相关酪氨酸激酶4FLT4)的表达降低(图5bc),通过qRT-PCR测量wtEK突变型Mesp1表达细胞中这些基因的表达,在wt-Mesp1过表达的细胞中显著诱导了Igfbp4Serpinb9CtgfTns1MrasMestRhouFlt4的表达。与wt-Mesp1相比,表达EK-mutantMesp1的细胞中MESP1靶标的表达显著降低(图5d),这表明这些基因的表达取决于MESP1DNA结合能力。qRT-PCR分析证实了该列表中一个基因EMP3的表达似乎被MESP1抑制(图5b-d)。进行ChIP-qPCR分析,搜索通过ENCODE获得的E-box结合因子的ChIP-seq数据集,并在MESP1目标基因组位点中鉴定了E-box结合模体基因。设计包含这些模体的寡核苷酸,并通过ChIP-qPCR测试MESP1的富集。结果表明,MESP1富集了所有测试基因的染色质基因座。因此,IGFBP4FLT4MRASCTGFMESTEMP3可能是MESP1的直接靶标(图5e)。为了确定MESP1的预后以及MESP1调控的24个基因特征,进行KM生存分析。在LUSC数据集中,MESP1调控的24个基因与不良生存率显著相关(图5f)。这些结果表明,MESP1直接调节基因特征的表达,这在癌症的多个特征中很重要,与患者生存不良有关。

 5.鉴定24个预测不良预后的MESP1靶基因

 

2.5异种移植动物模型中MESP1抑制肿瘤生长

为验证体外发现并评估MESP1敲低对体内肿瘤生长的影响,进行异种移植测定。如图6aA549细胞)和图6eH358细胞)所示,与对照组相比,shMESP1处理组的肿瘤较轻。shMESP1处理的A549细胞和H358细胞的肿瘤体积(图6b)显著低于对照组。对于A549细胞,在注射后38天处死小鼠,而对于H358细胞,在注射后15天处死小鼠,并分别切除肿瘤(图6c)。与shMESP15shMESP16肿瘤相比,A549(图6d)和H358(图6f)肿瘤的HE染色显示shControl肿瘤对周围组织的侵袭性更大。

 6. MESP1敲低的细胞减少肿瘤形成

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