一篇Science告诉你单细胞测序的文章思路

上周我们介绍了单细胞测序在发表高分文章中的应用情况,在这篇文章中我们为大家介绍了一篇近40分的nature reviews immunology综述说的单细胞测序的三个应用场景:

(1)分别研究病理和生理状况中不同的细胞亚群

(2)揭示某类细胞中的细胞亚群

(3)研究某类细胞(分化中的)的命运决定点

另外,怪阿姨还写过一篇文章,今天我们就以具体的例子来看看这个技术在我们具体开展研究时候的应用。

这篇文章是去年4月20号发表在Scicence杂志上的文章:

Developmental and oncogenic programs in H3K27M gliomas dissected bysingle-cell RNA-seq.Science 2018 04 20 ;360(6386)

我们知道Science杂志的主图比较少(文章正文是5页),这篇文章只有四个:

但是做的工作和研究内容都是非常多的,这一点可以从49页的补充材料里面看出来:

好了,下面我们说文章正题。

研究疾病:H3K27M gliomas,也就是组蛋白H3第27位赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M)的胶质瘤。

主要研究方法:单细胞测序。具体的策略是这样的,作者取了6位H3K27M胶质瘤患者的新鲜活检组织,制备悬浮单细胞,然后用流式分选(FACS),然后进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。这里大家注意单细胞测序前期细胞分选方法是流式分选。

结果:

1. H3K27突变型胶质瘤样本单细胞检测和结果整体展示

6个样本共测定了2458个细胞,所以文章的第一个图Fig1A展示的是这些细胞的基因在不同病人中的表达情况,而根据Marker基因的表达情况研究团队排除了两类非恶性细胞(nonmalignant )亚群(A图中的NM和B图中的Immune cell与Oligodendrocyte),接下来进一步从拷贝数变异和基因突变角度对“恶性细胞”基因水平的变异进行检测分析(WGS/WES),就是图中C和D展示的内容:

这一部分的结论是整体鉴定了6个患者单细胞层面RNA水平的表达变化及其在各患者中的表达谱和DNA水平变异情况,并进一步排除了非恶性的细胞亚群。

2. OPC恶性细胞亚群的确定和关键基因功能验证

接下来,对第一步中的2259个“恶性细胞”的表达模式和特性进行分析,共找到了4个模块亚群(program):(1)细胞周期;(2)星形细胞分化(AC-like);(3)少突细胞分化(OC-like)和少突胶质前体样细胞(OPC-like)(下图A)。然后,对模块进行打分分析后发现细胞增殖这样的“恶性特征”主要在OPC这个占比最高的细胞亚群,而OPC这个亚群具有干细胞的特性:既能自我更新,又可以分化为AC或者OC(下图B);下一步通过RNA原位杂交分别对AC、OC和周期的Marker进行检测(下图C):

在这一部分除了把OPC这个干细胞特性的恶性细胞亚群确定了下来,还找到了位置这个亚群特性的关键分子PDGFRA和BIM1(命运决定点),并通过CRISPR/Cas9基因敲除手段进行了细胞增殖表型的功能验证:

3. H3K27突变型胶质瘤与IDH基因突变型胶质瘤细胞构成和进化

由于H3K27突变型胶质瘤与IDH基因突变型胶质瘤在细胞组成上的相似性(均由AC、OC和干细胞特性细胞亚群组成),研究团队选取了IDH基因突变型胶质瘤作为对照,从细胞结构组成上,两者的AC样细胞组成比例类似,而OC和干细胞特性亚群比例相差较大(下图A-F),实际上在干细胞特性亚群分类上,H3K27突变型胶质瘤主要是OPC亚群,而IDH基因突变型胶质瘤主要是NPC亚群(neural precursor cell)(下图G),而在细胞周期相关基因的表达上,H3K27比IDH比重更高(下图H),这些与其更高的侵犯性相对应:

接下来是从基因变异、染色体单倍型的层面来揭示肿瘤的异质性和进化的过程,我们就不展开说了,可参见上图中的I-M图,特别是L图中的进化树。

 

4. H3K27突变型胶质瘤在不同模型中的差异评价

在这一部分,研究团队选取的不同的疾病模型,包括了病人的组织样本、PDX模型、神经球(GS)和分化的胶质瘤细胞(DGC),并通过单细胞测序的方法来看这些不同的模式在模拟最初始的病人组织样本时的特性,结果发现PDX是模拟程度最高的,而其它的模型只能部分模拟原始肿瘤的特性。

最后他们绘制了正常发育和H3K27突变型胶质瘤进化过程中的示意图:

大家可以看到这张图里面体现的信息包括了正常与H3K27突变型这一亚型胶质瘤进展过程中的细胞分化过程,也体现了具体的命运决定点(基因)的信息。

 

好了,文章的介绍就到这里了,最后我们说明一些想法:

单细胞测序技术的优势我们已经在用这个技术发表的文章中,每4篇中就有1篇10分+,还不赶快了解一下!里面做过介绍了,我们知道技术的进步会推动各个领域观念的个性,反过来很多好的idea如果没有技术的支持是没法实现的;再退一步说,很多时候大家不能毕业的原因不是没有idea,而是WB没做好,所以这个问题需要辩证的看。再者说,这篇文章里面用到的细胞分选技术是流式(FACS),而非微流控芯片;从文章来看,除了这个技术外文章的思路和分析也是我们需要学习的,这个算是研究门槛或者风险提示吧。上次我们发了单细胞测序的介绍后,很多同学留言说价格太高,做不起,我个人是完全理解的,也相信单细胞测序的价格肯定会大幅度下降,就像电脑的技术革新一样,可能10年后单细胞测序会成为像PCR一样的常规技术,可问题是,当单细胞测序成为我们能承担的常规技术后,肯定又会有新的技术是我们承担不起的,高精尖的技术和高分文章注定只能少数人有机会。

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