赵素文/王明伟/Babu合作团队揭示A类GPCR的共同激活机制

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR又称七次跨膜螺旋膜蛋白,是人最大的膜蛋白超家族(超过800个成员),参与视觉、嗅觉、味觉、神经传递、内分泌和免疫应答等人类几乎所有的基本生理功能,在细胞信号转导中发挥着关键的作用。目前已有475个药物靶向GPCR,占FDA批准药物的34%【1】。A类GPCR也被称为类视紫红质受体家族,是GPCR超家族中最大的家族,包括286个非嗅觉受体,乃是目前研究最多的GPCR家族。它们具有多个保守的特征模体(Motifs)如CWxP、PIF、Na+ pocket和NPxxY。自2007年第一个人源GPCR—β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor, β2AR的晶体结构【2】及2011年第一个GPCR-G蛋白复合物的晶体结构【3】被解析以来,随着结构生物学研究技术的不断发展,截止到2018年10月,A类GPCR已有45个受体的234个结构被确定。这些结构揭示了各受体间在配体结合模式、偶联G蛋白的亚型和激活方式等方面存在明显差异。依据相关配体的药理学特征,这234个结构可分为三类:拮抗剂或反向激动剂结合的非激活态(Inactive state,38个受体142个结构)、同时结合激动剂和G蛋白的激活态(Active state,8个受体27个结构)和只结合激动剂的中间态(Intermediate state,15个受体65个结构),其中有6个受体同时具有激活态和非激活态结构(bRho、 β2AR、 M2R、μOR、A2AR和κ-OR)

图1.A类GPCR的配体结合口袋、G蛋白结合口袋、以及激活时标志性的TM6的外翘。残基层面的共同激活机制尚不明确

GPCR的激活本质上是胞外侧激动剂结合和胞内侧下游效应蛋白招募互相耦合的别构过程,即受体从非激活态到激活态的构象转变(图1)A类GPCR激活的标志性特征是第六跨膜螺旋(TM6)胞内段部分的翘起,但TM6因何翘起、残基层面有哪些保守变化尚不清楚。前人研究多采用结构生物学、NMR等单分子技术或分子动力学模拟等研究特定受体的激活过程或方式,对家族层面的共同激活机制研究非常缺乏。这一方面是由于解出结构的受体数量有限,限制了家族层面对共有激活机制的探讨;另一方面是由于缺少可精确描述构象变化的计算工具,显然仅依靠肉眼或残基位移侧链是无法做到准确、系统地研究。2016年,英国科学家Madan Babu率领团队在Nature上发表论文,应用残基间接触(Residue contact)概念描述受体结构的残基接触网络,对同时拥有激活和非激活态结构的5个A类受体10个结构进行保守性分析,发现有6组残基对在激活过程中具有一致的残基间接触变化【4】这项研究认为A类GPCR的激活路径仅收敛于G蛋白结合区域的两对残基对即3×46—6×37和3×46—7×53,但遗漏了重要的保守模体如CWxP、PIF和Na+pocket等,也未能解释TM6末端因何翘起。因此,A类受体的共同激活机制有待发现。

2019年12月19日,上海科技大学iHuman研究所/生命学院赵素文助理教授、中国科学院上海药物研究所/国家新药筛选中心/复旦大学王明伟研究员和位于英国剑桥的医学研究委员会分子生物学实验室Madan Babu博士合作组成的研究团队在eLife上发表了题为“Common activation mechanism of class A GPCRs”的论文,首次揭示了完整连接配体结合口袋和G蛋白偶联区域的A类GPCR的共同激活通路,并获得相关功能性实验的验证。这项成果不仅加深了我们对GPCR信号转导机制的认识,而且对靶向GPCR的药物研发和孤儿受体的功能研究都具有重要的指导意义。

研究者们开发了一个计算生物学框架来定量和系统地描述激活过程中的构象变化,即使用残基接触打分(Residue-residuecontact score, RRCS评价残基对接触强度(Residue-residue contact strength),从而将三维的结构信息转化为二维的残基接触打分网络并由此实现对激活过程中残基构象变化的精确描述(ΔRRCS = RRCSactive − RRCSinactive)这一计算方法完全从蛋白质结构本身出发,不依赖于结构比对,且将整体或局部、显著或微小的构象变化系统地分成Switching (开关式)和Repacking(重排式)与Inter-helical(螺旋间)和Intra-helical (螺旋内)等两个层面的四种类型。为发现在激活过程中具有保守构象变化的残基对,该团队首先分析了6个受体(bRho、 β2AR、M2R、μOR、A2AR和κ-OR)的激活构象变化(ΔRRCS),筛选出其中ΔRRCS皆为正或负的残基对,通过进行全家族RRCS显著性分析(涵盖142个非激活态结构和27个激活态结构),最终发现A类GPCR中存在一条由34组残基对构成的共同激活通路(图2)这一通路完整连接配体结合口袋和G蛋白偶联区域,并有机整合这些序列保守但空间疏离的模体(如CWxP、PIF和Na+pocket和NPxxY等),在残基层面揭示了GPCR如何被激活,TM6为什么会翘起,各模体间如何相互配合完成跨膜信号转导。值得注意的是,这一通路是不同A类受体的数种效应蛋白的激活通路的共同部分(共性),每个受体仍然保留其独特的受体/配体/效应蛋白激活路径(个性)

 

图2. A类GPCR的共同激活通路

在研究跨膜螺旋的整体构象变化时,TM3和TM6间的所有4组残基对被用来计算两个螺旋间的接触分值(RRCSTM3-TM6),类似地的还有RRCSTM3-TM7和RRCSTM5-TM6。将所有已知的142个非激活态结构和27个激活态结构对应到由RRCSTM3-TM6和RRCSTM3-TM7构成的二维空间上,激活态和非激活态显现出迥然不同的特征(图3)激活态的RRCSTM3-TM6为零,而RRCSTM3-TM7通常大于5;非激活态的RRCSTM3-TM7一般接近或等于零,但RRCSTM3-TM6却分布广泛且基本大于零。这实际上反映出GPCR激活时具有共同的整体构象变化,即激动剂的结合触发TM6胞内段的往外运动从而远离TM3,这使得TM7可以往内移动从而靠近TM3,最终在胞内侧形成空隙以结合G蛋白等效应蛋白。此外,这一发现还揭示了TM3和TM6的胞内段的靠近并不是GPCR非激活态的特征,非激活态的本质是TM7和TM3的胞内段不接触。同样,激活态的重要特征除了TM6胞内段的翘起外,还有TM7胞内段向TM3的靠近。TM7的运动尽管不如TM6那么显著,但却是受体激活所必须的。

图3. A类GPCR的共同激活机制

研究团队采用实验手段对关键氨基酸残基进行突变,在受体持续激活或失活状态先验证了这一共同激活通路。以A2AR为例,15个设计的持续激活突变(Constitutively activating mutations, CAM,常译作组成性激活突变/本构激活突变,意为这种突变造成的激活是一种恒常状态,不易为其它因素所影响。此处意译为持续激活突变)中的6个和20个设计的持续失活突变中的15个都被cAMP功能实验所证实(图4上行),且它们的配体结合能力基本不受突变影响(图4下行),充分说明这些位点在受体激活过程中的关键作用。基于共同激活通路来设计持续激活或失活突变也将是该工作的一个重要应用。

图4. A2AR持续激活/失活突变的实验验证(a)cAMP水平和(b)受体结合活力。

此外,研究团队还发现GPCR致病突变明显富集在受体共同激活通路上,间接反映了共同激活通路上这些位点的重要性。作为行使激活功能的模块,共同激活通路使配体结合口袋和G蛋白偶联区域可以独立演化,研究者认为,这可能可以解释为什么上下这两个口袋的残基组成如此多样化,这种多样性使得GPCR成为最庞大最成功的细胞信号转导家族。

赵素文课题组周庆同助理研究员和王明伟课题组杨德华研究员为共同第一作者,赵素助理教授、王明伟研究员Madan Babu博士为共同通讯作者,上海科技大学iHuman研究所为第一完成单位。参与该项研究的还有美国奥古斯塔大学的科学家等。

原文链接:

https://elifesciences.org/articles/50279

 

1. Hauser, A. S.; Chavali, S.; Masuho, I.;Jahn, L. J.; Martemyanov, K. A.; Gloriam, D. E.; Babu, M. M., Pharmacogenomicsof GPCR Drug Targets. Cell 2018, 172 (1-2), 41-54 e19.

2. Cherezov, V.; Rosenbaum, D. M.; Hanson, M.A.; Rasmussen, S. G.; Thian, F. S.; Kobilka, T. S.; Choi, H. J.; Kuhn, P.;Weis, W. I.; Kobilka, B. K.; Stevens, R. C., High-resolution crystal structureof an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science 2007, 318 (5854),1258-65.

3. Rasmussen, S. G.; DeVree, B. T.; Zou, Y.;Kruse, A. C.; Chung, K. Y.; Kobilka, T. S.; Thian, F. S.; Chae, P. S.; Pardon,E.; Calinski, D.; Mathiesen, J. M.; Shah, S. T.; Lyons, J. A.; Caffrey, M.;Gellman, S. H.; Steyaert, J.; Skiniotis, G.; Weis, W. I.; Sunahara, R. K.;Kobilka, B. K., Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs proteincomplex. Nature 2011, 477 (7366), 549-55.

4. Venkatakrishnan, A. J.; Deupi, X.; Lebon,G.; Heydenreich, F. M.; Flock, T.; Miljus, T.; Balaji, S.; Bouvier, M.;Veprintsev, D. B.; Tate, C. G.; Schertler, G. F.; Babu, M. M., Diverseactivation pathways in class A GPCRs converge near the G-protein-couplingregion. Nature 2016, 536 (7617), 484-7.

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