SATQPCR:进行qPCR数据统计分析的网页工具

众所周知，qPCR 从来就不是让人省心的实验。小心翼翼的提 RNA，宝贝一样的呵护起来；兢兢业业的摸索最佳温度梯度，生怕引物探针一言不合就「罢工」；

好不容易跋山涉水来到最后一关，拿到了一大堆 Cq 值，可大神级的 SPSS、R 语言听起来就头大，更惶论轻松掌握了，不擅长统计分析的你是不是欲哭无泪？

终于，福音出现了 —— SATQPCR ¹

全称：short for Statistical Analysis Tool for Quantitative PCR Data

它是免费的网页版工具，无需安装软件，简单易用；完全遵循 MIQE 指南设计²（扩增效率、内参基因的选择等）；支持图片生成、t 检验和方差分析（事后检验采用 Tukey Test）。

闲话少说，直接上干货。

图文教程

1. 比如要研究处理后小鼠的三个靶标基因（Gene1、Gene2、Gene3）随时间（0h、2h、4h）的表达水平变化，有三个基因（Ref1、Ref2、Ref3）作为参照基因。

设置 Control 组（col）和处理组（M），有两个技术学重复（Sample Name 完全相同）和三个生物学重复（即 Sample Name 的后缀，小鼠 1、2 和 3）。

按照下图所示导出 Cq 值到 Excel 或者 txt，其中第二行为扩增效率，没有数值用 NA 表示。

2. 进入 SATQPCR 网页，点击「SATQPCR Tool」按钮即可到达数据上传页面。点击「选择文件」按钮将 example 数据文件上传。

3. 如果要做 ANOVA 分析，则需要选择 Yes 选项，同时上传 Factor 文件。

该文件含有变量的数量等信息，如下图所示，该实验包含处理因素和时间两个考察维度，处理因素有两个变量（处理 M 和不处理 col），时间有三个变量。上传后点击 upload。

4. 数据上传成功后会自动识别重复的数量。

内参基因可以由用户自己指定（fixed）或者由程序根据算法³自动寻找最稳定表达的基因（calculated），数量可以选择 2 个或者 3 个。

同时可以选择以某一个样本（如 col0h1）为 control 来建图，误差线可选择标准误 SE 或者标准差 SD。点击 Submit 提交。

5. 数据文件中包括表达量数据、柱状图和统计检验三部分，可以直接点击下载压缩的结果文件。

6. Normalize_Data 文件中包含每个靶标基因的均一化表达量。

Gene_柱状图展示了不同的 sample 中特定靶标的表达量（以 col0h1 为 control），Sample_柱状图展示了同一 sample 中不同靶标的表达量。

7. Sign.test 文件展示了特定靶标在不同样本中表达量的 t-test 检验的 p 值矩阵，下图以 Gene1 为例，可以看到 col0h1 样本与其他样本均有极显著的统计学差异（p＜0.01）。

8. summaryANOVA 及 summaryANOVA2 分别展示了单因素和双因素的 ANOVA 检验结果。

该实验中我们需要参考双因素的检验结果，可以看到 Treatment 因素具有极显著的统计学差异（双星号表示，最后一行有标注说明），这样需要对 Treatment 因素进行 Tukey Test。

9. tukeyTEST 给出了不同基因的检验结果，包括差值（diff）、95% family-wise 置信区间（lwr 和 upr）及 p 值。

是不是够 easy？

简化流程而又不出错是我们做数据分析的目标，这个网站都帮我们想到了。

可能很多人对最后的统计分析的解读无所适从，接下来我会推送一篇详细的关于 qPCR 数据统计分析的文章，对其中可能犯的错误一一列出，希望能够帮到大家。

工具网址：

http://satqpcr.sophia.inra.fr/cgi/home.cgi

参考文献：

1. Rancurel, Corinne, et al. “SATQPCR: Website for statistical analysis of real-time quantitative PCR data.” Molecular and cellular probes 46 (2019): 101418.

2. Bustin, Stephen A., et al. “The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.” Clinical chemistry 55.4 (2009): 611-622.

3. Vandesompele, Jo, et al. “Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.” Genome biology 3.7 (2002): research0034-1.