磷酸化修饰以及在磷酸化蛋白Western Blot中的方法

蛋白质在翻译过程中或翻译后会在氨基酸链上共价结合各种非肽类基团,形成翻译后的修饰,其中最常见的就是糖基化和磷酸化。对于蛋白质的各种修饰方式也一直是近年来国自然的研究热点。今天,想跟大家简单介绍一下磷酸化修饰以及在跑磷酸化蛋白时的一些心得

蛋白质磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上,磷酸化和去磷酸化几乎充满了生命体信号调节的所有过程,包括细胞凋亡、增殖等。真核生物的蛋白质磷酸化位点主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链的羟基上,不同的蛋白激酶可以识别和修饰不同的蛋白质位点。

怎样确定磷酸化位点?

研究磷酸化蛋白肯定是涉及到了信号通路,那么同一个蛋白,不同的信号通路或者说起到的作用不同,磷酸化位点也会有所差异。很多初次跑磷酸化蛋白的同学并不是清楚这一点,当你打开试剂公司官网的时候才发现,原来还有磷酸化位点的区别,不知道该买哪个抗体。

如果你研究的是某一经典通路,完全可以通过阅读相关内容的文献查找磷酸化位点。无论是相同疾病的研究还是对该通路研究的综述,这类的文章都可以。英文水平较差的同学也可以通过知网查找相关内容的博士论文,一般都会有详细介绍。

你也可以通过对总蛋白的研究入手。最快速的方法,总蛋白的抗体说明书中都会概括到常用的磷酸化位点和作用机制,从中选择即可

上述两种适用于新手和经典通路的研究,其实有点投机取巧,但不失为一种快捷的方法,你也可以选择在ExPASy数据库中查找蛋白质的翻译修饰情况。

那么如果查不到相关内容的话,或者还没有被研究过的磷酸位点,记住一点,磷酸化一般发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸这三种氨基酸上,只要将这三种氨基酸分别突变成其他氨基酸,再观察磷酸化蛋白的变化情况,就可以初步断定是谁在发挥功能了。目前最常用的是利用质谱技术分析蛋白质磷酸化位点,很多公司都有这个服务项目。我想如果你的实验室在研究一个预测的磷酸化位点,就一定有资金支持你去公司做这项实验。

磷酸化蛋白的提取有哪些注意事项?

磷酸化蛋白的提取除了正常蛋白提取需要注意的地方外,最重要的一点就是要避免在细胞裂解的过程中发生蛋白质磷酸化或去磷酸化,所以我们要在裂解液中另外加入磷酸酶抑制剂。目前市场上的RIPA裂解液就已经包含磷酸酶抑制剂的成分(这里需要注意一下,我们平常加入的PMSF是胆碱酯酶抑制剂,而非磷酸酶抑制剂,很多同学分不清楚),但是由于磷酸化蛋白的特殊性,还有一些特别需要注意的地方。

1、建议大家在提取磷酸化蛋白的裂解液中加入1mmol/L Na3VO4和1mmol/L NaF,可以保证较大程度的不发生去磷酸化。

2、磷酸化蛋白在提取的过程极易去磷酸化,所以在提取过程中使用的任何试剂都需要保证低温,4度预冷。

3、加入裂解液后的组织或细胞可以用注射器反复抽吸几次,尽量使磷酸化位点充分暴露,可以更容易的结合。这里不建议用超声振荡器:a)在超声的过程中温度会升高;b)超声的频率虽然会使位点暴露,但也会在不同程度上使磷酸化基团脱落,效果很难掌控。

4、磷酸化蛋白提取后,加入loading buffer煮沸。建议分装到多个Ep管中负80保存。蛋白质反复冻融会增加其降解程度,而对于磷酸化蛋白来说,磷酸基团的反复冻融同样会加快降解。

5、其实决定磷酸化蛋白结果好坏主要是抗体的选择,严格按照说明说的要求进行封闭和配制抗体的稀释比。我之前一直有误解,以为磷酸化抗体一定要在在5%BSA中进行封闭和配制一抗二抗,并没有仔细看说明书,这样的结果就是曝光后背景很高。其实说明书要求的是用not-fat milk进行配制,改进之后效果很好。当然这只是针对我的磷酸化抗体,大家还是要仔细看抗体说明书的要求。

6、做过磷酸化蛋白电泳的同学肯定都有过这样的经历,无论怎么调整一抗二抗的稀释比,曝光之后的条带要不就是非特异性背景很高,要不就是白板。如果是非特异性较高,除了可以试一下把BSA改成牛奶封闭,在换成牛奶封闭的同时也要降低封闭的时间,两个条件可以做一下平行试验摸索出最好的效果;如果是白板的情况,除了考虑样本的保存时间,可以适当提高二抗浓度。

7、由于磷酸化蛋白极易去磷酸化,所以蛋白样本最佳的保存期限是一周。

最后,利用蛋白免疫印迹的方法检测磷酸化蛋白的优点是蛋白检测的特异性好、分辨率高,适用于单个蛋白的磷酸化检测,但是对于信号较弱的磷酸化蛋白,且需要经过富集的,并不能精准分析。今天要分享的内容就是这些,希望能给像我一样的科研小白带来帮助!

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