外泌体(Exosomes)鉴定+外泌体示踪方法总结

在上次的文章外泌体(Exosomes)分离和储存方法总结中，我们总结了外泌体的分离和储存方法，今天我们来继续介绍外泌体的鉴定方法和失踪方法。

 

（一）外泌体鉴定方法

外泌体内容物 (芯片、测序、质谱、WB、QPCR、流式等方法)

Gutierrez-Vazquez, C., et al.ImmunolRev, 2013. 251(1): p. 125-42.

 

蛋白组分：

细胞骨架蛋白、信号转导相关蛋白、代谢酶类、抗原结合提呈相关蛋白

典型的Exosomes标记蛋白有：

四跨膜蛋白超家族，如CD9、CD63、CD81等；

细胞质蛋白，如肌动蛋白(actin)、钙磷脂结合蛋白(annexins)；

参与生物功能的分子，如凋亡转接基因2互作蛋白X(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、热休克蛋白(HSP70、HSP90)；整合素等。

Exosomes还含有细胞类型特异的标记蛋白，这种蛋白分子由分泌Exosomes的细胞所决定；

核酸组分：

Exosomes内还能够包裹mRNA、miRNA、lncRNA、mtDNA、circRNA，并转移至其它细胞中发挥生物学作用，Exosomes所包裹的内容物也是细胞类型特异的。

 

1、蛋白质-WB鉴定

Journalof Extracellular Vesicles 2015, 4: 2703

 

2、蛋白质- ELISA鉴定

Journalof Histochemistry & Cytochemistry 2015, Vol. 63(3) 181-189

 

3、蛋白质-流式细胞术鉴定

doi:10.1038/nature22341

4、蛋白质-质谱鉴定

Methods in Molecular Biology,vol. 1545

5、RNA-RNA提取

Molecular Immunology 50(2012) 278–286

6、RNA-测序鉴定

PLoSOne. 2016; 11(1): e0146353.

 

7、纳米颗粒跟踪分析：

纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle TrackingAnalysis ，NTA）是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一；相较于其他表征方式，NTA技术的样本处理更简单、更能保证外泌体原始状态、检测速度更快。

 

纳米颗粒跟踪分析—粒径检测原理：

NanoSight®浓度检测原理：

8、电镜

在外泌体研究中，电镜能够直接观察到样品中外泌体的形态。并且具有很高的分辨率，能够鉴别不同大小不一的外泌体。但对样品的预处理和制备上面要求较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的测量。而且由于外泌体经过了预处理和制备过程，无法准确的进行外泌体浓度的测量。

电镜视野中大多是略小于100nm的具有清晰膜的茶托样结构（立体结构），小图中显示免疫胶体金会附着到这些膜结构表面。

Current protocols in cellbiology(2006): 3-22

 

（二）外泌体示踪方法

1、染料-PKH67

PKH-67（green）亲脂性染料，可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光， PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26（red）具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。

Biomaterials. 2014Feb;35(7):2383-90.

 

2、染料- DIO & FM4-64

DIO是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现绿色荧光。DIO是一种亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。DIO在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。

FM4-64染料是亲脂性、水溶性的苯乙烯类化合物，对细胞无毒性作用，能与质膜及内膜细胞器特异结合后发出高强度的红色荧光

Biomaterials. 2014Feb;35(7):2383-90.

3、染料-DIR

DIR：近红外荧光的亲脂性DiOC18（“DiR”）在水中微弱荧光，当掺入膜中时具有高绿色荧光和相当好的光稳定性。

4、染料- SYTO RNASelect

SYTO RNASelect：绿色荧光细胞染料，一种细胞通透性的核酸染料，可选择性对RNA进行染色，当与RNA结合是可发出绿色荧光，可标记外泌体中的RNA内容物。

常规染料标记小结

•染料以非共价方式嵌入外泌体的膜双层。然而，染料可以在与外泌体相似的水溶液中形成染料聚集体或团块，在外泌体摄取实验中可能会给研究人员带来误导信息。

•染料标记之后对外泌体带来结构上的修饰，将改变其物理特性，也可能影响外泌体的功能性质

5、新方法-基于硫醇（thiol）基团的荧光标记EV

基于位于外囊泡表面的硫醇（thiol）基团的荧光标记方法，可通过共焦显微镜综合分析活细胞中前列腺癌来源的细胞外囊泡的细胞摄取。以这种方式标记的EV并不影响EV的大小，并且该方法对EV诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的能力没有影响。

Nanoscale. 2017 Sep 7

6、外泌体示踪慢病毒

外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63, CD81 和CD9）、热休克蛋白家族（HSP60, HSP70和HSP90），示踪病毒使用CD63或CD81作为生物标记，通过将CD63或CD81与荧光蛋白偶联，带荧光的膜蛋白会表达至外泌体膜上，便于后续进行、观察内化或其他实验。

（1）外泌体CRE-EGFP/DIO-mcherry示踪系统

（2）外泌体CD63-EGFP/tdTOMATO示踪系统