Co-IP实验解析—免疫共沉淀,用一个抗体沉淀两个蛋白

1、Co-IP和IP区别
Co-IP:研究的是体内自然状态下的蛋白质互相作用,不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的。
IP:根据抗原和抗体的特异性结合,利用抗体将靶标蛋白分离或纯化,检测某一种蛋白的表达情况。

2、Co-IP简单介绍

3、Co-IP 原理

ProteinA/G

ProteinA/G 能特异性地结合到免疫球蛋白的 FC 片段,因此能和抗体结合捕获复合物,而抗体与目标蛋白结合,目标蛋白和相互作用的蛋白结合。

X代表复合物。

Co-IP基本原理

4、Co-IP 流程
①样品准备

②蛋白抽提

细胞裂解后互作蛋白复合物的抽提。加入适量含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,冰上裂解30min后, 于4°C, 13000rpm条件下,离心30 min,取上清,即为总蛋白样品。

③体系孵育

④体系洗涤

⑤WB 检测

电泳→转膜→封闭→洗膜→一抗孵育→洗膜→二抗孵育→洗膜→显影曝光

5、Co-IP结果分析

6、Co-IP 拓展

Co-IP注意事项:

①温和的裂解条件
②使用明确的抗体
③使用对照抗体

 

7、Co-IP实验优点
相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;蛋白的相互作用是在自然混合蛋白状态下进行的,可以避免人为的影响;可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

8、Co-IP实验缺点
可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果。

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