Co-IP实验解析—免疫共沉淀，用一个抗体沉淀两个蛋白

1、Co-IP和IP区别

Co-IP：研究的是体内自然状态下的蛋白质互相作用，不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的。

IP：根据抗原和抗体的特异性结合，利用抗体将靶标蛋白分离或纯化，检测某一种蛋白的表达情况。

2、Co-IP简单介绍

3、Co-IP 原理

ProteinA/G

ProteinA/G 能特异性地结合到免疫球蛋白的 FC 片段，因此能和抗体结合捕获复合物，而抗体与目标蛋白结合，目标蛋白和相互作用的蛋白结合。

X代表复合物。

Co-IP基本原理

4、Co-IP 流程

①样品准备

②蛋白抽提

细胞裂解后互作蛋白复合物的抽提。加入适量含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30min后, 于4°C， 13000rpm条件下，离心30 min，取上清，即为总蛋白样品。

③体系孵育

④体系洗涤

⑤WB 检测

电泳→转膜→封闭→洗膜→一抗孵育→洗膜→二抗孵育→洗膜→显影曝光

5、Co-IP结果分析

6、Co-IP 拓展

Co-IP注意事项：

①温和的裂解条件

②使用明确的抗体

③使用对照抗体

 

7、Co-IP实验优点

相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然混合蛋白状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

8、Co-IP实验缺点

可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果。