RNA-FISH实验流程

在近十年的生物科研界,RNA可是个引领潮流的“弄潮儿”,mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA,吸引着无数科研狗们前仆后继,可谓是火的一塌糊涂。打开pubmed,随便搜几篇RNA的文章,几乎每篇都有RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)的身影,然而受限于实验仪器,技术或者经费的影响,对于一些童鞋来说,RNA-FISH始终如那海市蜃楼一样,可望而不可即。没关系,今天科研狗小张带你手把手做RNA-FISH!

图片来源:网络

首先介绍原理,利用核酸分子的碱基互补配对原则,将人工设计的外源核酸片段(即探针)与细胞中的待测RNA互补配对,经变性-退火-复性,即可形成靶核酸与核酸探针的杂交体,在荧光检测体系下对RNA进行定位,定性或半定量分析。

闲话少说,具体的实验流程奉上!

1.铺细胞于共聚焦小皿中,细胞融合度30%-50%开始实验;

2.弃去培养基,1x PBS静置清洗三次,5min/次;

3.FISH试剂盒-20度取出,平衡至室温;

4.4%多聚甲醛室温固定10min,配通透液4度预冷;(通透液:0.5%的TritonX-100 PBS溶液)

5.1xPBS清洗三次,5min/次;

6.1ml/孔预冷的通透液,4度静置5min;

7.1xPBS清洗三次,5min/次;

8.200ul/孔预杂交液,37度封闭30min;(预杂交液:Blocking Solution:Pre-hybridization=1:99,37度孵育至透明澄清后分装保存)

9.杂交液37度预热;

10.避光,5ul探针加入200ul杂交液中;

11.弃去预杂交液,200ul/孔加入含探针的杂交液,避光,37度杂交过夜;(加入杂交液时避免起泡)

12.提前配好杂交洗液1、2、3,42度预热;(杂交洗液1、2、3分别为4x、2x、1x的SSC溶液。可先配置20xSSC,方法为8.765g NaCl+4.41g柠檬酸钠→50mldd水,调PH值至7.0,再逐步稀释)

13.避光,42度杂交洗液1清洗三次,5min/次;

14.避光,42度杂交洗液2清洗两次,5min/次;

15.避光,42度杂交洗液3清洗一次,5min/次;

16.避光,1xPBS室温5min;

17.避光,100xDAPI用1x PBS稀释成1x PBS,100ul/孔,染色10min;

18.避光,1xPBS清洗三次,5min/次;

19.共聚焦显微镜拍照,Image Pro Plus处理数据。

注意:

1.  本实验前后需大概总需22次清洗,手法务必轻微,不要把细胞洗掉,如果感觉细胞贴壁能力不强,可提前在小皿中铺入0.2%的明胶增加细胞贴附力;

2.  第十步以后,操作需避光,防止曝光。

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