mRNA的胞内研究技术路线(研究思路)

眼看2019年就快过完了，老板交给你的标书完成了吗？实验方案搞定了吗？

 

RNA也分为很多种了，像miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA等，前面也有蛮多的文章介绍过了，咱们今天主要介绍mRNA的研究路线。

mRNA的研究也分细胞外和细胞内，细胞外的研究技术很多，咱们今天了解一下mRNA的细胞内研究技术和策略：转录、成熟、出核、翻译、降解。

mRNA的一生其实很短暂，从基因转录开始，到RNA前体分子加工成熟，出核到胞质中，在核糖体中翻译成蛋白，然后被RNase降解，完成了使命。

 

（1）硬技术介绍

1. 细胞固定后mRNA胞内显影

技术：smFISH、branched DNA FISH、Sequential hybridization smFISH

单分子荧光原位杂交（smFISH）

普通FISH只能定性，而定量版本就是smFISH，它是一种新的RNA定量分析方法，能报告转录本丰度和空间定位，。

 

Branched DNA FISH

这个技术就是设计一些一级DNA探针的二级探针，加强荧光信号

MERFISH

MERFISH是一个高度多重化的smFISH成像方法，可以在单个细胞中鉴定数千种RNA的拷贝数和空间定位。该技术使用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量，可谓高逼格的FISH技术。

2. 活细胞RNA胞内显影

活细胞中RNA要实时观测，这里面也需要进行荧光显色，和“固定”状态的细胞内RNA观测不同，活细胞状态下不能影响RNA的翻译，所以探针需要针对非翻译区。

Molecular beacons

这种设计是很聪明的，首先合成互补的DNA探针，然后一端加载荧光基团，另外一端加载淬灭剂，而DNA探针末端有2、4个碱基互补，这样在天然状态下，该探针是没有荧光的，只有探针和RNA结合后，才会发光显影。

Spinach-like aptamers、Stem-loop labeling

这两种技术都采用发光基团（荧光素）和探针分开的策略，先让探针渗透到细胞中结合，然后加荧光素进去结合，最后发光的条件性发光的策略，一般设计探针时放在非翻译区。

（2）一条mRNA的一生：转录、成熟、出核、翻译、降解

动态变化就是时间轴和空间分布上mRNA的变化。

转录起始监控：

酵母细胞从葡萄糖培养液到半乳糖培养液环境中，GAL基因群会激活表达，这叫做条件表达。

GAL1 smFISH显示半乳糖培养液中的某些细胞的GAL1开始大量表达，而常规基因DOA1的表达模式是一成不变。

蓝色的是DAPI，红色的是mRNA

 

mRNA出核：

这里有个概念，那就是mRNA出核并不是单独出核，而是需要形成mRNP（信使核糖核蛋白体），转运到核膜孔，这里用Spinach-like aptamers、Stem-loop labeling、Molecular beacons方法显示mRNA的位置，而同时需要使用核膜孔蛋白的抗体，显示mRNA已经在核膜孔上了。

红色是核膜孔蛋白、绿色是mRNA

 

mRNA的翻译过程：

这里还是要用到Spinach-like aptamers、Stem-loop labeling、Molecular beacons以及观察新生蛋白的Suntag技术。

红色是未开始翻译的RNA，绿色是翻译的蛋白，翻译中的蛋白是黄色的

 

SunTag实质上是一套分子挂钩，能够将多个拷贝的生物活性分子特异性地挂到可用来靶向一些基因或其他的分子的蛋白质支架上，用来检测特异蛋白的翻译情况。利用SunTag显著放大了通常用来标记细胞内分子绿色荧光蛋白的发光信号。这样获得的信号非常之强，因为通过显微镜观察，可追踪分子马达中的单个分子。

胞外研究mRNA那就太多技术了，想Q-PCR、RNA-seq、RIP、RNA pulldown等，技术路线中最重要的一个环节就是RNA的加工过程，胞内胞外的技术知道一点是大有裨益的。

P.S.胞内研究分子时，试剂小分子进入胞内的效率是一种非常严重的问题，因为需要保证小分子能充分大量进入胞内才可行。

 参考文献：

1 Imaging mRNA In Vivo, from Birth to Death

2 The emerging molecular biology toolbox for the study of long noncoding RNA biology

3 Methods Mol Biol. 2016;1361:77-90