MTT与CCK8比色法的实验细节和注意事项

细胞增殖实验就是对细胞生长的测定,常用的方法有MTT、CCK8以及流式检测。阅读大量文献发现,如果想证明一个药物或者说是一个作用条件对细胞生长的影响,基本上大家都采用MTT或CCK8结合流式的双标准来证明作用效果。所以,今天先给大家介绍一下MTT和CCK8比色法的实验操作和注意事项。

 

 

MTT实验操作

 

1、在96孔板中培养细胞,设置对照组(细胞+无血清培养基)、实验组和空白组(无血清培养基),可以采用如下图的排版方式:

 

 

2、在对照组和实验组中,每孔加入细胞悬液100ul,培养24小时;

 

3、24小时后,吸出培养基,对照组和空白组每孔各加入100ul无血清培养基,实验组每孔加入100ul基础培养基配制的药物,继续作用12或24小时;

 

4、药物作用完毕后,每孔加入50ul MTT,继续作用4小时;

 

5、弃掉每孔中的MTT,每孔加入150ul的DMSO或异丙醇。然后震荡10分钟,使孔底的紫色结晶充分溶解;

 

6、在酶联免疫机器上测定吸光度,波长为550nm或490nm。

 

7、细胞存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)*100%。

 

注意事项

 

1、细胞密度:MTT要检测的只是细胞的增殖能力,所以不用保证孔内细胞铺板一定要均匀,只要保证孔与孔之间的细胞数量大致相同就可,也因此细胞重悬很重要。每孔加入之前,都需要吹打混匀细胞,但即便如此也很难保证每个孔的细胞数量大致一致。所以我们设置了6组实验组,以便计算结果时可以有所取舍。

 

2、对于MTT而言,预实验很重要。预实验要摸清楚两点:a)细胞该如何稀释;b)药物浓度。网上很多人建议将细胞数稀释到某个数值才是最合适的,但我认为只要保证每个孔内的细胞数在70%左右,且各个孔内细胞数量大致相同就可,不需要强求一定要达到某个数值,现实中,这一步需要多次摸索。

 

3、药物浓度的确定需要做一个时间梯度,铺板和上述相同,只需把各个实验组改成各个作用时间就可以了。至于说药物浓度的确定,网上有很多确认方法,个人建议以IC50值作为药物浓度即可。计算方法,某园子里都有,就不在这里介绍了。

 

4、MTT作用之后,一定要小心吸走培养液,以免将孔内的紫色结晶吸走。有条件的实验室,这一步可以采用离心机将沉淀充分离心到孔底,防止被吸出。如果没有这种类型的离心机,可以在测量吸光度的时候,将酶联免疫的机器震荡时间调制5分钟,最起码可以保证沉淀充分溶解。

 

5、切记一定要使用无血清的基础培养基,一是可以排除血清对细胞生长的影响;二是血清的存在会对吸光度的测量产生影响。

 

以上是MTT比色法的介绍,MTT比色法因为涉及到吸出培养基溶解沉淀的操作,所以更适用于贴壁细胞,悬浮细胞最好选用CCK8检测细胞增殖,下面给大家介绍一下CCK8操作的注意事项。

 

 

 

CCK8实验操作

 

CCK8的优势在于对细胞没有毒性,可以直接加入细胞中长时间孵育,而不用考虑试剂本身对细胞带来的影响。

 

1、向96 孔板中每孔加入细胞100ul,置于培养箱中孵育24小时,96孔板的排版情况和上述MTT相同,在这里不重复介绍了。

 

2、向各孔中加入 10ul的CCK-8 检测溶液。如若检测的细胞增殖或毒性试验,需在此之前加入作用药物培养适当时间,例如6h/12h/24h等,然后再加入CCK8检测液。

 

3、培养箱中孵育 1~4 小时,最佳反应时间以细胞具体显色程度为准。

 

4、读数前可在摇床上温柔混匀,酶标仪在 450nm 波长处检测每孔的吸光度。

 

5、细胞存活率(%)= [(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(实验孔吸光度-对照孔吸光度)]×100

 

抑制率(%)= [(对照孔吸光度-实验孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100=IC50

 

注意事项

 

1、CCK8法检测细胞生长情况基于的原理是脱氢酶催化的反应,如果实验处理条件中存在还原剂的影响,应事先去除。如果实验条件中存在还原物质,需单独测定还原物质的空白吸光度。如果还原物质的吸光度很小,可以忽略不计;但如果吸光度很大,则需要去除培养基,再用培养基洗涤细胞3次,然后再加入新的 100ul培养基和10ul CCK-8 溶液进行检测。

 

2、CCK-8没有具体规定反应时间的长短,以具体反映最佳显色的时间为主。因为不同的细胞反应时间、显色标准都不一样,所以一定要设置预实验。预实验中,可以先做几个孔摸索一下接种数量和培养时间。

 

3、悬浮细胞比贴壁细胞难显色。在加入CCK-8培养后,可每隔一小时观测一下颜色的变化情况,或者之间用酶标仪检测更为准确。

 

4、CCK8作用时间越长,OD值就越大,所以对于作用时间也不是越长久越好,要把OD值控制在1左右。

 

5、CCK8要求检测孔内不能有气泡。

 

6、如果不能马上检测吸光度,可将培养板置于4℃冰箱避光保存,但也要在24小时内完成检测。

 

总之,无论是MTT还是CCK8,前期预实验摸索条件极为重要!今天就分享到这里了,希望对大家有所帮助!

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