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有一个基因如何筛到这个基因的抑制剂?

药物筛选作为医学实验常用的手段,在许多领域都发挥着重要的作用。许多对实验一筹莫展的临床同学可以跟着小编一起来看一下这篇文章中的科研思路。

 

1.表型筛选HMGB1在RAW 264.7巨噬细胞中诱导炎症介质产生和细胞毒性

 

HMGB1诱导RAW 264.7细胞的浓度依赖性肿瘤坏死因子α(TNFα)分泌,这种作用被IFN-γ加强,MTT检测细胞毒性反应在时间点(48小时,72小时)变得更加明显。用HMGB1处理RAW 264.7细胞1.5小时并表达用TLR信号传导途径阵列分析TLR相关基因,除TNFα外,HMGB1还上调多种促炎细胞因子(IL1a,IL1b,IL6,TNFβ)和趋化因子(Ccl2,MCP-1,Cxcl10)基因,以及抗炎细胞因子IL10。HMGB1介导的反应也与核因子κB(NF-κB)的上调相关。

 

 

 

2.通过数据库筛选药物:通过基于细胞的筛选鉴定HMGB1诱导的TNFα产生抑制剂

 

基于细胞的筛选超过5,000种临床药物,天然产物和药理活性化合物的重点库确定了约2%的化合物,其抑制TNFα的产生,而不会影响细胞活力,显示测试的5,646种化合物的TNFα/活力结果。超过50%的抑制TNFα产生的化合物是糖皮质激素,第二类是β-肾上腺素。然后在3和10μM确认化合物的活性。

 

 

通过基于细胞的筛选鉴定糖皮质激素的药理学增效剂鉴定增强糖皮质激素作用的化合物,在地塞米松(3μM)存在下进行NIH临床收集化合物文库的随访筛选。将RAW 264.7细胞用地塞米松(3μM)与测试化合物预处理 18小时。从上清液测量TNFα产生,并通过MTT测定法测量细胞的存活力。筛选鉴定出β2激动剂(沙丁胺醇,沙美特罗),磷酸二酯酶(PDE)抑制剂咯利普兰和前列腺素E1作为糖皮质激素作用的协同增强剂。

 

 

3.药物联用:糖皮质激素/β-肾上腺素能激动剂协同作用:作用机制

 

使用不同浓度的泼尼松龙(原型糖皮质激素)和沙丁胺醇(原型β2肾上腺素能激动剂)协同处理RAW 264.7细胞,并暴露于HMGB1(5μg/ ml)18小时。在上清液中测量TNFα分泌。沙丁胺醇(1μM)与泼尼松龙联合使用,在100nM泼尼松龙时,该组合达到其全部潜力(约70%抑制)。同样地,泼尼松龙(1μM)与300nM沙丁胺醇组合达到其全部潜力(约70%抑制)。

 

 

泼尼松龙和沙丁胺醇均使TNFαmRNA水平降低50%; 两种化合物的组合协同抑制TNFαmRNA的转录。

 

 

HMGB1诱导细胞外信号调节激酶1/2(ERK1 / 2,p44和p42)和p38以及IκB磷酸化的早期持续激活。这表明糖皮质激素/β-激动剂组合对HMGB1介导的细胞信号传导的调节具有上游调节成分。

 

 

进一步表明糖皮质激素/β-激动剂组合对HMGB1诱导的基因转录的影响,在趋化因子Ccl2和Cxcl10以及TLR2和TLR9存在的情况下,β-2激动剂的抑制作用是显着的; 对于TNFα,证实了糖皮质激素和β-激动剂的协同抑制。

 

 

鉴于糖皮质激素和β受体激动剂都代表交感神经 – 肾上腺 – 髓质轴的内源激素,皮质醇和/或肾上腺素/去甲肾上腺素 是否会影响HMGB1-诱导TNFα的产生。用皮质醇(0.7μM),去甲肾上腺素(0.5ng / ml),肾上腺素(0.5ng / ml),地塞米松(1μM)和沙丁胺醇(1μM)预处理RAW 264.7细胞,并暴露于HMGB1(5μg/ ml) 18个小时 在上清液中测量TNFα分泌。皮质醇肾上腺素和去甲肾上腺素的组合,抑制了HMGB1诱导的TNFα反应。

 

 

4.动物体内研究:糖皮质激素/β-肾上腺素能激动剂在体内协同作用

 

泼尼松龙和沙丁胺醇的组合在体内有效地抑制了BalGB / c雄性小鼠中 HMGB1诱导的TNFα产生,并且这种效果比单独任一种药剂的作用更明显。相反,糖皮质激素受体阻滞剂米非司酮或β-受体拮抗剂普萘洛尔不能增强HMGB1诱导的TNFα产生。

 

由此可见,利用药物已知靶点,再加上已知的药物数据库筛选,最后得到已知药物的新功能,或联合用药的新作用,再做一些机制方面的研究,发2-3分的SCI是很轻松的。唯一工作量大的是5000多种药物的筛选,不过现在市面上有许多可以做筛选的公司,可以供临床医生选择,这样既可以节省时间又可以高效的开展实验,赶快行动起来吧。

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