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一文带你了解蛋白质组学机制研究的思路

之前本号汇总了 LncRNA 研究的一些基本方法和套路。
 
其实,LncRNA 的研究是可以举一反三,融会贯通在其他的组学研究中,比如:蛋白质组学的研究,也可以通过测序检测等技术,寻找差异表达显著的蛋白,然后进行机制探索和生物标记物等研究。
 
今天,我们一起来看看蛋白质组学机制研究的套路。
1. 蛋白质常用定量检测方法
首先,介绍一下蛋白质检测的常用方法,有小伙伴可能会说不就是 Western Blot、ELISA 等实验吗?的确,说到蛋白检测通常离不开免疫,但 Western Blot 等是传统的免疫技术,而非单纯的蛋白质定量检测。
 
目前常用的蛋白检测技术,有基于质谱技术的不带标记的 Label Free、带标记 TMT/iTRAQ(同位素标记)等,免疫技术的液相悬浮芯片以及 PRM 等。
 
由于基于质谱技术的检测原理稍偏向物理方面,PRM 可以看做 qPCR 的二代测序,感兴趣的了解一下,这里就不多赘述。
 
我们来了解一下免疫技术的液相悬浮芯片,又叫流式荧光技术 xMAP(flexible Muti-Analyte Profiling)是综合荧光编码、双激光检测以及流体动力等来进行 96 孔板中单孔的多指标共同检测技术。
 
蛋白的定量检测,其实是内含的各种细胞因子检测比如有巨噬细胞、T 细胞、表皮细胞以及一些活性小分子蛋白,液相悬浮芯片是在 96 孔板里加入能偶联不同抗体的微珠制成,经过特殊的免疫或者染色等反应,完成各种细胞因子的定量检测。
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液相悬浮芯片原理
(图片来源:文献截图)
下面我们现学现卖,以来源于 Oncogene 期刊(IF:6.6)的文献「WDR74 modulates melanoma tumorigenesis and metastasis through the RPL5–MDM2–p53 pathway」为例,来看看通过蛋白定量检测来研究组学机制的研究。
2. 研究背景
真核生物中 WD 重复序列蛋白 74(WDR74)充当 60S 核糖体装配因子对于核糖体生物发生至关重要, 参与核糖体的发生和应激以及调控犬癌细胞转移。
 
这些发现表明 WDR74 也可能参与人类癌症的发展,然而到目前为止,有关 WDR74 潜在作用在人类癌症的特征尚未明确。
3. 研究思路
首先,作者通过建立的黑色素瘤转移细胞株,并通过验证一些关键的指标证明细胞系建立成功。
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图片来源:文献截图
紧接着,作者使用蛋白质定量检测技术,将建立好的黑色素瘤细胞系进行蛋白定量检测,结果表明转移性细胞株中 WDR74 的表达较对照组明显增加;同时通过 PCR、Western Blot 实验也证明 WDR74 表达的差异确实存在。
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图片来源:文献截图
于是,作者又在组织里检测了 WDR74 的表达,结果同样显示 WDR74 的表达是增加的。
 
目前为止,作者前期工作是利用蛋白组学技术筛选到特定基因——WDR74,然后,通过一系列实验证明确实表达与众不同。
 
接着,进行基因实验敲除,采用特定细胞系和基因编辑技术对 WDR74 进行敲除,通过检测相应的细胞表型(比如,细胞周期变化、增殖、侵袭、转移等)试图证明这个目的基因与引起的性状吻合。
一文带你了解蛋白质组学机制研究的思路
图片来源:文献截图
结果表明,假设成立,确实如此——WDR74 能加速细胞周期并促进细胞增殖以及有抗凋亡功效。
 
那么问题来了,既然如此,作者研究为何会出现这样的原因——接下来便是蛋白组学机制的探索。
 
作者采用特定细胞系的 WDR74 过表达和敲除细胞株实验,进行相应的结果鉴定发现,p53、MDM2、RPL5 的表达量均与 WDR74 的表达量相关。
 
除此之外,下游基因 VEGFA 等,也与 WDR74 表达相关,同时作者证明了 p53 和 MDM2 的结合需要 WDR74 的辅助,切断 p53 与 MDM2 就切断了 WDR74 对细胞的影响。
 
一文带你了解蛋白质组学机制研究的思路
图片来源:文献截图
根据复杂的上下游联系以及实验的逻辑佐证,最后作者绘制了以下机制图。
一文带你了解蛋白质组学机制研究的思路
图片来源:文献截图
4. 启发学习
总体来看,本文是利用蛋白定量检测来研究组学机制的研究,是一篇比较典型的机制探究型文章——「WDR74 modulates melanoma tumorigenesis and metastasis through the RPL5–MDM2–p53 pathway」说明是特定基因(WDR74)通过某种通路(RPL5–MDM2–p53 pathway)引起某些疾病或进程(melanoma tumorigenesis and metastasis)
 
这种套路题目,在国自然中非常常见且命中率较高,我们来学习一下整体的研究方法和思路:
 
蛋白组机制研究,首先用蛋白定量检测方法发现蛋白表达差异的存在,并利用组学技术在细胞水平上筛选并验证特定蛋白的表达这点和非编码 RNA 研究有点类似
 
接着确定特定蛋白,采取敲除、过表达等方式进行功能研究,并检测预期的表型性状,这一步是关键,与预期相符接着进行蛋白组学机制探索,在动物水平进行表型验证并通过目的基因上下游逻辑关系绘制出机制图。
 
当然,最后如果能锦上添花,还有临床评估和验证性实验。那么,高分期刊就在下个拐角等你吆。

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