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文献解读:研究癌症,外泌体与凋亡信号通路的思路

2020年4月29日,来自浙江大学医学院附属邵逸夫医院的曹利平团队在The FASEB Journal杂志上发表了题为Pancreatic cancer-derived exosomes induce apoptosis of T lymphocytes through the p38 MAPK-mediated endoplasmic reticulum stress的研究性论文[1],发现胰腺癌来源的外泌体被转移到外周血T淋巴细胞,活化的p38 MAPK在介导T淋巴细胞凋亡的信号通路中起着至关重要的作用。                       

文献解读:研究癌症,外泌体与凋亡信号通路的思路

1. 引言
胰腺癌是第四大最致命的恶性肿瘤,5年生存率为8%。虽然手术切除是延长生存率的主要治疗方法,但只有18%的胰腺癌患者在诊断时进行根治性切除。不幸的是,80%患者预后不良。一般术后进行化疗或放疗干预,然而对生存益处也是有限的。多项研究表明,高度免疫抑制的肿瘤微环境在胰腺癌的发生发展中起重要作用。现在认为,免疫系统衰竭引起的T细胞功能障碍和缺失是产生免疫抑制肿瘤微环境的原因。
外泌体是直径在50 – 150nm之间的膜包裹的小泡,通常认为外泌体是一种从组织位点到循环的长距离细胞间通信模式。当释放到细胞外环境时,外泌体可以通过细胞间穿梭在局部和全身传递信号,促进肿瘤发育和免疫耐受。有研究报道癌细胞释放的外泌体抑制对肿瘤细胞的免疫反应,特别是诱导T淋巴细胞凋亡。然而,胰腺癌来源的外泌体在T淋巴细胞凋亡中的作用,及关键信号通路尚不清楚。

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外泌体生物发生的示意图(来源于文献[2])
2. 材料和方法
1) 细胞培养:人BxPC-3细胞系;人外周血单核细胞(PBMCs);外周血T淋巴细胞
2) 外泌体的纯化和验证:从人BxPC-3细胞或tdTomato-BxPC-3细胞的无血清上清中纯化外泌体,透射电子显微镜成像验证。
3) 体外T淋巴细胞治疗:将分离的外泌体加入到外周血T淋巴细胞
4) 外泌体转移的荧光示踪:将分选的T淋巴细胞与tdTomato外泌体共培养孵育后,激光共聚焦显微镜观察。
3. 研究结果
1)外泌体鉴定和T淋巴细胞摄取
首先,研究者将胰腺癌来源的细胞系BxPC-3培养在无外泌体的培养基中,用超离心法从BxPC-3培养上清中分离出外泌体,PBS重悬。透射电镜显示外泌体的直径为40 – 120 nm。Western blot检测外泌体蛋白标志物CD9、CD63、HSP70。为了追踪胰腺癌来源的外泌体,使用慢病毒载体系统(tdTomato-BxPC-3)稳定转染CMV启动子驱动的tdTomato-tagged CD63基因。TdTomato外泌体从TdTomato – bxpc -3培养上清中分离。将人外周血T淋巴细胞与tdTomato外泌体孵养4天,使用共聚焦显微镜观察,发现胰腺癌来源的外泌体从癌细胞转移到T淋巴细胞。

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2)胰腺癌来源的外泌体诱导T淋巴细胞凋亡,抑制抗肿瘤免疫
接下来,研究者检测了有无外泌体处理下的T淋巴细胞的凋亡。用胰腺癌来源的外泌体处理T淋巴细胞不同时间至4天,然后用Annexin V-FITC和PI处理。流式细胞术分析显示,与对照组相比,2 ~ 4天T淋巴细胞凋亡明显增加。因此,在接下来的实验中,研究者选择了4天的T淋巴细胞培养,外泌素处理的T淋巴细胞中检测到caspase-3和PARP的剪切增加。而且,研究者评估了胰腺癌来源的外泌体(Exo-T)或PBS (Ctrl-T)的体外细胞毒性活性,Ctrl-T具有显著的抗肿瘤活性,Exo-T则无效,且CD8+ Exo-T细胞毒活性明显降低。

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3)RNA-sequence和基因富集分析
再下来,为了检测胰腺癌来源的外泌体改变外周血T淋巴细胞基因表达的可能性,研究人员使用外周血CD3+T淋巴细胞与孵育4天进行RNA-seq。与Ctrl-T组相比,Exo-T组上调151个基因,下调26个基因。基因集富集分析(gene -setenrichment analysis, GSEA)发现,与Ctrl-T相比,Exo-T差异表达基因参与了凋亡基因集和未折叠蛋白反应(unfolded proteinresponse,又称ER stress)基因集。

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4)内质网应激参与胰腺癌来源的外泌体诱导的细胞凋亡
内质网应激的激活与多种细胞系的凋亡有关,经典内质网应激途径涉及三个主要途径,包括IRE1、PERK和ATF6。在参与UPR的基因集中,研究者发现PERK和ATF4在胰腺癌来源的外泌体处理后显著上调。
为了研究胰腺癌来源的外泌体是否在T淋巴细胞凋亡中诱导内质网应激,研究者测定了各种参与内质网应激信号通路蛋白。外泌体显著上调了PERK、ATF4和CHOP的表达,并增加了eIF2的磷酸化。ATF6的表达和IRE1的磷酸化在Exo-T和Ctrl-T之间没有显著差异。这些结果表明外泌体诱导的内质网应激依赖于PERK–eIF2α–ATF4–CHOP信号轴。

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5)信号通路研究,外泌体诱导的T淋巴细胞凋亡依赖于活化的P38 MAPK
经典的MAPK蛋白包括p38、ERK和JNK。磷酸化的MAPK蛋白是导致凋亡的PERK-CHOP信号轴的下游靶点。在凋亡基因集中编码MAPK信号通路组分的基因和151个上调mRNAs中,研究者发现胰腺癌来源的外泌体处理后,IL1A、IL1B、JUN和CHOP mRNA均显著上调。通过Western blot 和qPCR进一步验证p38 MAPK磷酸化、总ERK和磷酸化ERK的表达水平增加。

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为了确定p38 MAPK和ERK的磷酸化参与外泌体来源的凋亡,研究者使用SB203580抑制p38 MAPK的磷酸化,使用U0126抑制ERK的磷酸化,使用流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响。SB203580(200μM)治疗显著抑制外泌体诱导的细胞凋亡,而U0126处理的Exo-T细胞凋亡无明显差异。而且SB203580处理的T淋巴细胞,抑制p38 MAPK激活的增强,减少JUN的上调表达,抑制外泌体诱导的PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号轴的活性。这些结果表明磷酸化的p38 MAPK参与了外泌体诱导的细胞凋亡。

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进一步研究了SB203580对外泌体诱导的内质网应激的影响,Exo-T细胞中检测到JUN、PERK、ATF4和CHOP的下调,eIF2蛋白磷酸化被抑制。SB203580处理降低了caspase-3和PARP的剪切,进一步抑制了外泌体诱导的caspase-3和PARP的剪切。与Exo-T相比,经过SB203580处理的Exo-T细胞毒活性明显增强。这些结果提示,SB203580处理恢复Exo-T细胞毒活性,磷酸化的p38 MAPK可能参与了外泌体破坏细胞毒性的过程。
4. 总结
胰腺癌来源的外泌体被T淋巴细胞整合,并激活T淋巴细胞的p38 MAPK。磷酸化p38 MAPK诱导内质网应激的激活,随后激活PERK -eIF2 -ATF4-CHOP信号轴,诱导细胞凋亡。此外,活化的p38 MAPK也上调了DUSP1,有报道称p38 MAPK去磷酸化(绿色虚线),可能作为MAPK信号的反馈调控机制。SB203580抑制活化的p38 MAPK,降低内质网应激,保护T淋巴细胞免于凋亡(实线表示该研究结果,虚线表示之前报道的研究结果)。

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5. 研究思路

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看到这里是不是对癌症,外泌体与凋亡信号通路研究有了更深的了解,希望能对你有所启发。好啦,今天的文章解析就到这里了,我们下次再见吧!
参考文献
[1]   Shen, Tao, Zihang Huang, Chengfei Shi, Xiaofan Pu, Xiaodong Xu, Zhengrong Wu, Guoping Ding, and Liping Cao. “Pancreatic cancer‐derived exosomes induce apoptosis of T lymphocytes through the p38 MAPK‐mediated endoplasmic reticulum stress.” The FASEB Journal 34, no. 6 (2020): 8442-8458.
[2]    de la Torre Gomez, Carolina, Renee V. Goreham, Joan J. Bech Serra, Thomas Nann, and Martin Kussmann. ““Exosomics”—a review of biophysics, biology and biochemistry of exosomes with a focus on human breast milk.” Frontiers in genetics 9 (2018): 92.

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