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核酸(DNA及RNA)提取与样品保存技巧

核酸提取

基因组DNA提取:基因组DNA带有生物体所有的遗传信息,用于基因检测,遗传病诊断等等。

RNA提取:用于基因表达水平的分析,如对于Coding或者Non-codingRNA等这个RNA的含量分析。常用于NorthernBlot assayRT-PCRRT-QPCR,分子克隆,体外翻译等等实验。

(蛋白质提取蛋白质水平分析。用于分析组织或细胞的蛋白质组成,含量,蛋白复合体组成成分,两种或几种蛋白之间的相互作用等等)。分析方法:各种蛋白质电泳,Western-BlotIPCo-IP,氨基酸测序等等。)

 

核酸(DNA及RNA)提取与样品保存技巧

DNA提取:目的是既把DNA与蛋白质,脂类糖类分开,又要保持DNA分子的完整性。大致过程:含有SDS和蛋白酶K的裂解液消化分解蛋白质,用酚,氯仿/异戊醇提取分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇或异丙醇沉淀使DNA析出。

关键作用物质有——SDS:破环细胞膜,核膜,并使组织蛋白和DNA分离。EDTA:可螯合钙离子,抑制Dnase的活性。Proteinase K:消化蛋白质,使蛋白质降解成小肽和氨基酸。氯仿:大分子量的有机溶剂,可以有效地使有机相和水相分离,从而使蛋白质和核酸有效分离。

总RNA提取:一般用TRIzol裂解液,可以在一小时内从组织细胞等生物材料中提取总RNA!主要成分是苯酚。可裂解细胞释放出核酸和蛋白质。可以使样品匀浆,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时,TRIzol中的其它成分可抑制Rnase的活性,并可保持RNA的完整性。  大致过程:TRIzol裂解后,加入氯仿以后,溶液分为水相和有机相,RNA存在于水相,取出水相,用异丙醇沉淀,RNA析出。总RNA中,rRNA占80%,mRNA占5%,tRNA和其它RNA占15%。

需要注意的是:尽量全部过程使用Rnase free的离心管和枪头。

如果提取组织RNA,玻璃器皿150度干烤4小时;0.1%DEPC浸泡15分钟,研钵用前要事先冷却;塑料制品可在0.5M的NaOH中浸泡10分钟,水洗高压等等,一切试剂用DEPC水或核酸酶Free的水配置。做实验的时候,带口罩,帽子,手套。整个实验过程,动作迅速,不要拖沓。组织研磨或细胞裂解时,尽量在冰上进行,最大可能地降低Rnase的作用。50-100m组织加入1mL TRIzol;

如果是细胞样品:贴壁细胞,直接把TRIzol加到培养皿中,3.5cm dish加1ml。悬浮细胞,5-10X106细胞沉淀加1mL。

氯仿提取之后清亮透明的区域(红线)为RNA,离心之后切不可摇动,否则中间白色的DNA(黄线)会鱼目混珠,吸取RNA的时候最好留一点点,不要吸完,否则很可能吸到DNA。最下面红色区域(绿线)是蛋白质脂质。

核酸(DNA及RNA)提取与样品保存技巧

样品保存:  1.组织或细胞沉淀可直接冻于-80度冰箱。2.细胞可在TRIzol里冻存在-80度冰箱;组织加TRIzol,匀浆后,可冻于-80度冰箱至少保存一个月;3.RNA沉淀保存于75%乙醇中,2-8度可保存一周,或-20度中 可保存一年以上;4.提纯并溶于DEPC水中的RNA分装保存于-80度冰箱中。

得率低可能因素:A. 样品裂解或匀浆处理不彻底;B. RNA沉淀没有完全溶解。样品匀浆时加的TRIzol过少;匀浆样品后未在室温下放至5分钟;吸取水相时混有有机相;RNA沉淀未完全溶解等等。

RNA降解原因:A.组织取出后没有马上冷冻。B.待提RNA样品没有保存于-80度而是存在4度或者-20度;C. 细胞在胰蛋白酶里处理时间太长;D.试剂和所用器械,离心管没有经过DEPC处理,造成RNA降解。

要记住:RNA不像DNA那样坚不可摧,牢不可破。RNA其实很作,一言不合就降解!

所以你要是看谁不爽,在ta提取RNA的时候找ta唠唠嗑,RNA闻到你的口臭(唾沫)会立刻害羞的死去(分解)。

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