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  2. 研究进展

李大力课题组开发超高活性的系列胞嘧啶碱基编辑器(hyCBEs)

据 ClinVar 数据显示,人类的遗传病中58%是由于单个碱基突变引起的【1】。虽然Cas9激活的同源重组可以实现对突变位点的精确修正,但效率非常低( 0.1%~5%)【2】,严重阻碍了其应用。而通过将胞嘧啶脱氨酶与nickase Cas9(D10A)融合而成的胞嘧啶碱基编辑器BE3(Cytosine base editor, CBE), 在不引入 DNA 双链断裂同时也不需要重组修复模板的情况下对编辑窗口(距离PAM远端起的第4-7位)内的胞嘧啶脱氨,实现C>T的碱基转换,具有更加安全、高效、精准的特点【3】。在基因治疗,农作物遗传育种,药物筛选等领域展示了广泛的应用前景【1】
自CBE被报导以来,多种策略对其进行了优化改进。例如在提高活性方面,主要是通过密码子优化及增加更强的核定位信号【4】、用高活性的胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A或 Anc689替换 APOBEC1【4,5】、融合额外的 UGI 增加编辑效率和产物纯度【6,7】。而通过对脱氨酶的分子进化获得的evoAPOBEC1-BE4max大幅提高针对GC motif中胞嘧啶的编辑效率【8】。虽然这些方法一定程度上提高了CBE的活性,但是对于编辑窗口的影响不大,特别是更靠近PAM序列的碱基仍然很难被编辑到。因此,是否有新的策略可以提高编辑活性而又能扩增靶向碱基的范围,一直是碱基编辑器优化的难点。
2020年5月11日,华东师范大学李大力课题组在Nature cell Biology发表了题为Increasing the efficiency and targeting range of cytidine base editors through fusion of a single-strand DNA binding protein domain的研究论文,报道了一系列超高活性的胞嘧啶碱基编辑器(hyCBE),证实其提高编辑效率、扩展编辑窗口的同时保持高效精准的工作性能。
李大力课题组开发超高活性的系列胞嘧啶碱基编辑器(hyCBEs)
由于CBE主要是以单链DNA(ssDNA)为底物,因此研究团队猜测如果增强脱氨酶与ssDNA的结合能力,是否能增加脱氨酶作用时间而增强活性呢?于是,通过对10个非序列特异性的ssDNA结合结构域(ssDBD)与CBE进行融合,通过筛选,发现将Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1与Cas9n之间能显著提高碱基编辑活性,同时编辑窗口也大幅增加(图1)。通过10个靶点的分析,在编辑窗口C4-C8中,hyBE4max比BE4max活性提高了1.5-2倍,而在C9-C15这些更靠近PAM的碱基中,活性最多提高了18倍。
李大力课题组开发超高活性的系列胞嘧啶碱基编辑器(hyCBEs)
图1. hyCBE模式图及对不同ssDBD的筛选结果
为了验证融合ssDBD的策略是否具有通用性,用类似的方法改造A3A-BE4max和特异性识别TC motif中C碱基的eA3A-BE4max, 获得了hyA3A-BE4max 和 hyeA3A-BE4max。通过大量的实验证明,相比A3A-BE4max,hyA3A-BE4max活性在C3-C11位点提高了1.2-2倍,C12-C17位点活性提高3-4倍,通过小鼠胚胎显微注射也进一步证明其在编辑更靠近PAM序列的碱基的独特优势。与eA3A-BE4max 相比,hyeA3A-BE4max仍然能非常特异性地靶向TC motif中的C,编辑窗口由C4-9拓展为C4-15,活性最高提高了 257倍;而在小鼠胚胎中靶向Dmd基因在C13位编辑效率也大大提高,F0小鼠平均编辑活性提高了近60倍,F0代小鼠获得DMD纯合点突变的效率达到40%。
论文进一步验证hyCBEs特别是hyeA3A没有检测到DNA或者RNA层面的脱靶,具有非常高的精准性。最后,通过比较多种CBE在编辑胎儿血红蛋白(HBG1/2)启动子-117位点的能力发现,hyeA3A能在红细胞前体细胞系中精确催化-117G>A的转换,而周围同时发生碱基突变(bystander mutation)的细胞相比,具有更高的HBG表达水平,展示了 hyeA3A-BE4max 对于精准治疗β-血红蛋白病的巨大潜力。该工作开发了能提高编辑活性拓宽靶点范围的一系列新的CBE,为基础研究与基因治疗提供了新的优化工具。
华东师大生命科学学院2016级博士研究生张晓辉,2018级硕士研究生陈亮和2017级博士研究生朱碧云为该论文的共同第一作者,华东师范大学为第一作者单位,李大力教授为本文通讯作者,刘明耀教授对本课题给予了悉心的指导,同济大学毛志勇教授课题组在实验室提供了重要支持。
原文链接:https://doi.org/10.1038/s41556-020-0518-8

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