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通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡

前面跟大家读了几篇自噬相关的文献,想必大家应该对自噬的套路应该了解的差不多了,今天应小伙伴的要求跟大家学习一篇铁死亡的相关文献,研究的疾病还是阿尔茨海默病(AD),铁死亡也是近年来细胞死亡领域的研究热点,目前相关的研究还不多,今天我们还是从最简单的文献读起。
 
这篇文章的题目是:Ablation offerroptosis regulator glutathione peroxidase 4 in forebrain neurons promotes cognitive impairment and neurodegeneration,前脑神经元铁死亡调控因子谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)的消融会促进认知损伤和神经退变。2017年发表在Redox Biology杂志,18年影响因子是7.793,19年预估会突破10分。
 
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
先来看研究背景:
主要交待了几个方面的内容:
1.阿尔茨海默病(AD)的流行病学和神经元细胞凋亡的关系,指出凋亡不能完全解释AD的发病机制。
2.氧化应激损伤、脂质过氧化、铁死亡的概述以及和AD的可能关系。
3.铁死亡和GPX4的关系。
4.本研究的目的和结论,证明铁死亡是一种神经退行性机制。
 
通过背景就可以了解到这篇文章的关键内容:
1.疾病:阿尔茨海默病(AD)
2.疾病相关细胞:神经元细胞
3.研究水平:动物
4.机制研究:铁死亡
研究方法:
这篇文章主要是动物实验,用了GPX4条件缺失的小鼠(GPX4BIKO)和对照小鼠(GPX4(f/f)),用三苯氧胺(TAM)处理诱导GPX4消融,给予维生素E缺乏的饲料喂养老鼠,研究维生素E对神经退变的影响,然后还给予了铁死亡抑制剂Liproxstatin-1处理,研究抑制铁死亡对神经退变的作用。检测方法包括:PCR检测GPX4的消融,水迷宫试验检测小鼠空间学习和记忆能力,脑组织病理和免疫荧光染色,Western-blot(WB)检测NeuN,synaptophysin,GFAP,ERK1/2,Iba-1,4-HNE,Gpx4,Caspase-3,SNAP25的蛋白表达。PCR检测了IL-6、TNF-a、GFAP、Iba-1的mRNA表达。
 
我们来看研究结果:
1. Gpx4BIKO小鼠前脑神经元Gpx4的条件消融。
 
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
A:PCR检测的Gpx4(rGpx4),用loxP位点和引物位点的Gpx4等位基因图显示Gpx4的消融情况。
B:PCR检测TAM治疗后2周、15周大脑皮质(CC)、海马(HC)、脊髓(SC)和肝脏(Li)中rGpx4的表达。
C: Western-blot显示,在TAM治疗后2周和15周,Gpx4BIKO的CC和HC组织中Gpx4表达降低。
D: 海马(CA1区)图像显示,接受TAM治疗后2周,Gpx4BIKO小鼠的Gpx4荧光反应降低。
E:Western blot显示在TAM治疗后2周Gpx4BIKO小鼠中4-HNE蛋白含量升高。
 
2. Gpx4BIKO小鼠空间学习和记忆能力损坏
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
A:在TAM治疗后6周和12周,Gpx4BIKO和对照组小鼠在Morris水迷宫(MWM)任务中的逃逸潜伏期。
B:12周MWM任务第5天的Gpx4BIKO和对照组小鼠的典型MWM游泳图。
C:在12周MWM任务的第6天,在目标象限中进行探测试验的时间百分比。
D:Gpx4BIKO和对照组小鼠的平均游泳速度没有差异(收集于采集试验的第5天)。
E:完成12周MWM任务后评估Gpx4BIKO和对照组小鼠的滚轴试验能力。所显示的数据是经过1天训练使老鼠适应这项任务的潜伏期(平均4次试验)。
以上结果都是水迷宫试验的结果,主要是证明了Gpx4BIKO小鼠空间和学习记忆能力下降。
 
3. 认知受损的Gpx4BIKO小鼠中海马神经变性的研究。
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
A:Western-blot显示Gpx4BIKO小鼠大脑皮层(CC)和海马(HC)组织中神经蛋白突触素(Syn)、突触体相关蛋白-25(SNAP)和NeuN的水平,结果显示和对照组相比,这些蛋白在Gpx4BIKO小鼠HC组织中都是显著下降的。
B:Nissl染色显示Gpx4BIKO小鼠(黑箭头)HC组织CA1区神经元丢失, Nissl阳性细胞数明显下降。
C:Fluoro-Jade C(FJC)荧光染色显示Gpx4BIKO小鼠HC组织CA1区出现神经元退变。
 
4. 认知受损的Gpx4BIKO小鼠铁死亡的特征。
 
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
A:Western blot检测大脑皮层(CC)和海马(HC)的4-HNE水平,结果显示Gpx4BIKO小鼠CC和HC组织中4-HNE 增高。
B:Western-blot检测Gpx4BIKO小鼠和对照组CC和HC组织ERK1/2的磷酸化水平,结果提示Gpx4BIKO小鼠ERK1/2磷酸化水平升高。
C:Western-blot显示Gpx4BIKO动物的CC或HC中存在procaspase-3和激活的caspase-3。
 
5.认知受损的Gpx4BIKO小鼠中的神经炎症。
 
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
A:Western-blot显示Gpx4BIKO小鼠大脑皮层(CC)和海马(HC)组织中星形胶质细胞增生标志物(GFAP)和小胶质细胞增生标志物(Iba-1)的表达。
B:免疫荧光图像显示海马CA1区胶质增生标志物GFAP(绿色)和Iba-1(红色)的表达。白色箭头表示CA1锥体神经元层有小胶质细胞浸润。
C:PCR检测促炎细胞因子(IL-6,TNF-α)和胶质增生标志物(GFAP,Iba-1)在CC组织中的mRNA表达
 
6. 喂食缺乏维生素E饮食的Gpx4BIKO小鼠神经退变加剧。
 
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
A:从第1天开始接受TAM治疗后,喂食维生素E缺乏饮食的Gpx4BIKO小鼠和对照小鼠的滚轴试验能力。给予维生素E缺乏饮食(Gpx4BIKO-VED)的Gpx4BIKO小鼠在TAM治疗后1周表现出后肢紧扣的表现。
B:Western-blot显示Gpx4BIKO-VED小鼠在TAM治疗后1周神经蛋白NeuN、突触素(Syn)和SNAP25水平降低,胶质增生标志物GFAP和Iba-1水平升高。
C:Western-blot显示,与DMSO处理的Gpx4BIKO-VED小鼠相比,经铁死亡抑制剂liproxstatin-1处理的Gpx4BIKO-VED小鼠在TAM治疗后1周内的HC神经变性(NeuN,Synaptophysin,SNAP25)和神经炎症(GFAP)减弱。
 
作者最后有个总结的图(这个不在正文里):
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
最后作者得出结论:铁死亡的三个显著特征(铁调节失调、脂质过氧化、炎症)是AD和相关痴呆的重要前驱指标。铁死亡是AD的重要病理机制。
 
这篇文章对于新手主要有以下几个学习的点:
1. 提出了一个新的AD病理机制,就是铁死亡和神经元退变和神经炎症之间的关系。
2. 动物的学习和记忆能力检测方法:水迷宫试验。Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)实验是一种强迫实验动物(大鼠、小鼠)游泳,学习寻找隐藏在水中平台的一种实验,主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力。被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、海马/外海马研究、智力与衰老、新药开发/筛选/评价、药理学、毒理学、预防医学、神经生物学、动物心理学及行为生物学等多个学科的科学研究和计算机辅助教学等领域,在世界上已经得到广泛地认可,是医学院校开展行为学研究尤其是学习与记忆研究的首选经典实验。试验系统由水迷宫水池、摄像系统以及Xeye动物行为轨迹分析系统组成。实验的具体方法如下:
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
3. 铁死亡调节因子GPX4是这篇文章的重点,主要用了GPX4条件缺失的小鼠,然后还用了铁死亡抑制剂,主要目的是研究铁死亡被阻断后神经退变和炎症的变化,从而证明铁死亡的作用。
 
关于GPX4可能大家还不了解,它实际上是铁死亡的核心调控因子铁死亡的主要发生机制如下(摘自丁香园论坛):
GPX4诱导铁死亡:GPX4 能降解小分子过氧化物和某些脂质过氧化物,抑制脂质过氧化。研究发现,若细胞中 GPX4 表达下调则会对铁死亡更敏感;相反,若上调 GPX4 的表达,则会产生对铁死亡的耐受。因此,将GPX4抑制后将诱导细胞发生铁死亡。

抑制胱氨酸谷氨酸转运受体 (systemXC-)诱导铁死亡:通过systemXC-,谷氨酸与胱氨酸以1:1比例交换,因此,谷氨酸的水平会影响到systemXC- 的功能。细胞外高浓度的谷氨酸会抑制systemXC-从而诱导铁死亡。敲除systemXC-的小鼠由于细胞外谷氨酸水平减少,可以防止神经毒性损伤。

p53介导铁死亡:
p53是一种抑癌基因,通过下调systemXC-组分SLC7A11的表达抑制细胞对胱氨酸的摄取,导致GPX活性降低,削减细胞抗氧化能力,增强细胞对铁死亡的敏感性。同时,研究发现,在人肿瘤细胞中SLC7A11过度表达,这种过表达能够抑制活性氧诱导的“铁死亡”,同时削弱p53 3KR介导的对肿瘤生长的抑制作用。
通过AD神经退变机制的研究文献初识铁死亡
 
这篇文章虽然发表在将近10分的杂志上,但是仍然存在一些缺陷:
1. 只有一个水平的研究,就是只有动物实验,如果能从细胞水平层面再进行一些铁死亡机制的研究可能更加完善。
2. 虽然主题是铁死亡,但是全文除了检测GPX4这个铁死亡调节因子,还缺少铁含量以及ROS水平的检测,所以本文的检测手段并不完整。
 
这里总结了下铁死亡的检测指标和常用试剂:
1. 检测指标:1)形态学透射电镜观察细胞形态;(2)细胞水平:铁水平检测、活性氧(ROS)检测(荧光探针法)、线粒体膜电位;(3)分子水平:铁死亡相关基因及蛋白(如PTGS2、NOX1、FTH1、COX2、GPX4、ACSL4)表达的检测(PCR、WB);(4)亚细胞水平:线粒体形态观察。
2. 常用试剂:(1)System Xc抑制剂:Erastin 及其类似物;(2)GPX4抑制剂:RSL3,ML162;(3)GPX4和CoQ10抑制剂:FIN56;(4)FINO2可间接抑制GPX4,诱导脂质过氧化;(5)荧光探针:C11-BODIPY、LiperFluo;(6)铁死亡相关蛋白抗体。
这篇文章同样可以凝练成一个课题:GPX4缺失诱导的铁死亡参与阿尔茨海默病神经元退变的机制研究

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