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文献解读:5分肾癌之自噬基因预后预测模型文章思路

今天给大家文献解读的是2020年1月发表在Aging (Albany NY)(IF=5.5)杂志上的文章“Autophagy-related gene P4HB: a novel diagnosis and prognosis marker for kidney renal clear cell carcinoma ”。这篇文章中作者通过5个独立队列一步步筛选出和肾透明细胞癌相关的预后基因P4HB,并通过RT-PCR进行细胞学实验验证,最后分析了P4HB的预后价值。

Autophagy-related gene P4HB: a novel diagnosis and prognosis marker for kidney renal clear cell carcinoma
自噬相关基因P4HB:一个肾透明细胞癌的新型诊断和预后标记物

一.研究背景

  • 肾细胞癌(RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,占成年人恶性肿瘤的3%。而RCC最常见的病理类型是肾脏肾透明细胞癌(KIRC),其预后不良、病发率高。

  • 自噬是一个由多组自噬相关基因调控的多步骤的溶酶体降解过程,可促进营养物质循环,满足细胞代谢需求,与肿瘤生成密切相关。有报道指出自噬可以作为肾细胞癌中EMT的潜在治疗靶点。

二.分析流程

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三.结果解析

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图1. P4HB的筛选与预后价值(详见分析流程部分)
 

1.P4HB的筛选
1.1从 TCGA-KIRC 中筛选 ARGs

首先比较KIRC和正常肾脏种222ARGs表达水平,ARGs在KIRC和正常肾脏种差异表达。然后对222个ARGs进行ROC分析,以AUC ≥ 0.9 和p < 0.0001为标准筛选出41个ARGs差异表达基因(表1)。通过NCBI  Pubmed 搜索,发现41个ARGs基因中有31个在KIRC有意义(舍弃),而未被证明的10个基因进一步分析。

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表1. TCGA初步筛选出的41个自噬相关基因
 

1.2通过GEO数据库进行第一次验证

在GEO的独立数据集GSE40435和GSE53757通过GEO2R筛选差异表达的基因,得到1128个基因,和上述10个基因取交集,得到3个基因:CASP4,P4HB和GABARAPL1。

1.3通过Oncomine数据库进行第二次验证

使用Oncomine中的Beroukhim数据集验证CASP4,P4HB和GABARAPL1基因,发现GABARAPL1低表达,而CASP4,P4HB高表达。

标准:KIRC 组/对照组的表达比例> 2倍

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表S3. Beroukhim数据集验证差异基因
 

1.4通过HPA数据进行第三次验证

在HPA数据库通过对比59个KIRC和正常肾脏组织切片,分析CASP4、P4HB和GABARAPL1的蛋白表达水平,发现在KIRC组织中P4HB的蛋白质水平明显增加(图2A),而GA4ARAPL1降低(图2B),而CASP4的蛋白质表达水平在KIRCs和正常组织之间没有显着差异,因此,舍去CASP4。

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图2. P4HB和GABARAPL1典型免疫组化图像
 

1.5通过实验进一步验证
  • 图3AB:TCGA数据库中P4HB和GABARAPL1的ROC分析,发现两者的AUC> 0.9且p <0.0001,均可很好区分KIRCs与正常肾脏。

  • 图3C:RT-PCR验证P4HB和GABARAPL1在正常肾上皮细胞(H293T)和KIRC细胞(OR-SC-2和Caki-1)的表达水平,发现P4HB的mRNA高表达与数据分析一致,而GABARAPL1的mRNA也高表达与数据分析不一致,因而舍去。

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图3. P4HB和GABARAPL1的ROC分析与实验验证
 

2.P4HB的预后意义
  • 图4A:TCGA-KIRC 数据库中以P4HB中位表达将患者分成高表达组和低表达组,并绘制生存曲线,证明低表达组OS较好。

  • 图4B :使用STRING数据库探索P4HB相关的已知蛋白和预测蛋白,发现CALR(得分= 0.999),HSP90B1(得分= 0.998),HSPA5(得分= 0.991),PPIB(得分= 0.986),MTTP(得分= 0.987) ,P4HA3(得分= 0.994),PDIA6(得分= 0.994),PRKCSH(得分= 0.987),CALU(得分= 0.991)和DNAJC3(得分= 0.986)。

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图4. P4HB的生存分析与相互作用图
 

通过卡方检验探究P4HB表达与KIRC患者临床病理参数之间的关系,发现高表达组比低表达组临床分期、复发和死亡比例高。

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表2. P4HB与临床特征的联系
 

单因素和多因素Cox回归分析,临床晚期和高P4HB的mRNA表达导致OS较差,而多因素分析证明了临床分期和P4HB的mRNA表达是独立的预后指标。

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表3. P4HB是独立的预后指标
 

GSEA分析TCGA数据集中P4HB高表达组和低表达组,发现戊糖磷酸途径(图S2.A),果糖和甘露糖代谢(图S2.B),氨基糖和核苷酸糖代谢(图S2.C),半乳糖代谢(图S2.D),IGA生成的肠道免疫网络(图S2.E),蛋白酶体(图S2.F),N-聚糖生物合成(图S2.G)在高表达组中富集。

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图S2. P4HB的生物学意义
 

最后小结一下,作者通过首先5个队列筛选出2个和肾透明细胞癌相关的ARGs,随后,通过 RT-PCR 进行细胞验证,确定只有P4HB在正常细胞和肾透明细胞癌有明显差异。进而,通过单因素和多因素分析确定P4HB可以作为肾透明细胞癌OS的独立预后标记。最后,作者进行了P4HB的生物学意义分析。

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