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补骨脂酚诱导人乳腺癌MCF-7细胞S期周期阻滞及机制研究

摘  要:目的 研究补骨脂酚对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用及其机制。方法 采用噻唑蓝法(MTT法)考察补骨脂酚对MCF-7细胞生长的影响;采用流式细胞术检测补骨脂酚处理后细胞周期分布情况及活性氧(ROS)的产生;利用荧光显微镜观察补骨脂酚对MCF-7细胞核的影响;采用蛋白免疫印迹法检测补骨脂酚作用下MCF-7细胞凋亡、周期相关蛋白和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族蛋白的表达;引入ROS清除剂及MAPK家族蛋白抑制剂考察其在补骨脂酚作用下对MCF-7细胞生长抑制率和细胞周期相关蛋白表达的影响。结果 补骨脂酚可以呈时间、剂量依赖性抑制MCF-7细胞生长,其抑制作用明显强于阳性药5-氟尿嘧啶。补骨脂酚可诱导MCF-7细胞产生ROS,同时上调p-p53及p21蛋白表达水平,下调细胞周期相关蛋白CDK2和CyclinA2表达水平,进而引起细胞发生S期阻滞。而上述影响可被ROS清除剂Tiron逆转,表明ROS参与补骨脂酚诱导的S期阻滞。加入p38MAPK抑制剂SB203580后,细胞产生的ROS水平降低,表明ROS的产生依赖于p38MAPK途径。结论 补骨脂酚抑制MCF-7细胞增殖的作用与其引起细胞发生S期阻滞有关,ROS参与S期阻滞过程。

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤,是全球女性癌症死亡的主要原因之一,其发病率占所有癌症病例的23%,死亡率达14%[1]。近年来我国乳腺癌发病率及死亡率呈明显上升趋势,在女性生殖系统恶性肿瘤死因中,乳腺癌已从第2位升至第1[2]

恶性肿瘤的发生发展变化十分复杂,但正气虚弱是恶性肿瘤发生发展的主要病因病机已被广泛认可。《诸病源候论》记载:“积聚者,由阴阳不和,脏腑虚弱,受于风邪,搏于脏腑之气所为也”。《医宗必读》云:“积之成也,正气不足而后邪气踞之”。《外证汇编》云:“正气虚则成岩”。可见,正气虚弱是肿瘤发生的根本原因之一[3],故扶正固本是恶性肿瘤的基本治则,扶正类中药常被用来改善患者体质,达到“扶正即祛邪”的效果,起到抗肿瘤作用[4]

补骨脂Psoralea corylifolia Linn. 作为传统中药,最早记载于《开宝本草》,属扶正类中药,具有温肾助阳、固精缩尿、温脾止泻、纳气平喘之功效,临床应用广泛。现代研究证实,补骨脂具有抗肿瘤、抗菌、抗疟疾、抗抑郁及增强免疫力等多种活性[5]补骨脂酚(bakuchiolBAK)是从补骨脂种子中分离得到的一种异戊二烯酚萜类化合物。据报道,BAK在体内、外对于肺癌、前列腺癌、口腔癌等肿瘤细胞均具有明显的生长抑制作用[6-8]。陈红莉等[9]研究发现BAK可以明显抑制人乳腺癌T-47DMDA-MB-231细胞增殖,但机制不明确。目前对于BAK抗乳腺癌的作用机制研究较少。本研究通过考察BAK对于人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响,初步揭示BAK在体外抗乳腺癌作用相关机制,为其进一步的临床应用提供理论依据。

1  材料

1.1  细胞

MCF-7细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2  药品与试剂

BAK由天津中医药大学高秀梅教授惠赠,经HPLC测定质量分数99.5%BAK无菌条件下溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,−20℃冻存。药品使用时,用DMEM培养液稀释至所需浓度(DMSO0.05%)。

DMEM培养基(美国Gibco公司);TBD胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司);噻唑蓝(MTT)、吖啶橙(AO)、2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针、PD98059SB203580SP6001254,5-二羟基-1,3-苯二磺酸二钠盐(Tiron,美国Sigma公司);Caspase-3p53p-p53Ser15)、cdc2、细胞周期蛋白D1Cylcin D1)、Cyclin B1Cyclin A2、周期蛋白依赖性激酶2CDK2)、CDK4JNKp-JNK1/2/3Thr183/Thr185)、p38p-p38 MAPKThr180/Tyr182)、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司);二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);5-氟尿嘧啶(5-FU,批号100187-201203,质量分数≥99.6%),中国食品药品检定研究院。

1.3  仪器

CO2恒温培养箱(上海Thermo公司);超净工作台(苏州苏净集团安泰公司);超纯水仪(四川成都优普公司);倒置显微镜(Motic公司);荧光显微镜(日本Olympus公司);电泳槽(北京六一仪器厂);转移槽、垂直电泳槽(北京百晶生物技术有限公司);流式细胞仪(美国BD公司);酶标仪(美国BioTek公司);高速冷冻离心机(上海Heal Force公司);摇床(金坛市新航仪器厂)。

2  方法

2.1  细胞培养

MCF-7细胞接种在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中(含100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素),于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待贴壁细胞生长成致密单层时,进行传代培养。

2.2  MTT实验

取处于对数生长期的MCF-7细胞,以1×105 /mL的密度接种于96孔培养板中,每孔100 μL。于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h,分别加入BAK5-FU 10.716.024.036.054.0 μmol/L,或分别提前1 h加入不同的抑制剂,培养12243648 h后,弃去孔内培养液,每孔加入100 μL 5 mg/mL MTT,继续孵育2.53.0 h,弃去孔内液体,每孔加入150 μL DMSO,酶标仪490 nm处测定吸光度(A)值,并计算细胞增殖抑制率。

增殖抑制率=(A对照A实验)/A对照

2.3  AO染色检测细胞凋亡

MCF-7细胞以2.5×105/孔接种于6孔板中,培养24 h后,加入30 μmol/L BAK,继续培养48 h后,细胞用10 μg/mL AO染色30 min,荧光显微镜下观察细胞核的形态。

2.4  流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期的MCF-7细胞接种于25 mL培养瓶中,密度为5×105/mL。培养24 h后,加入终浓度为30 μmol/LBAK或提前1 h加入100 μmol/LTiron,分别作用12243648 h。将药物处理后的细胞用PBS1次,胰酶消化后,合并PBS和消化液于离心管中,离心弃尽上清,加入500 μL PBS混悬细胞,预冷的70%乙醇−20 ℃固定过夜,1 200 r/min离心10 min,弃尽上清,每份样品加入含RNase50 μL碘化丙啶(PI1 mg/mL),避光、冰浴30 min后,用流式细胞仪检测,每个样品计数1×104个细胞。

2.5  流式细胞仪检测活性氧ROS水平

取对数生长期的MCF-7细胞,将细胞密度调整至3×105/mL,接种于6孔板中,培养24 h后,加入终浓度为30 μmol/LBAK分别作用12243648 h,或提前1 h加入TironSP600125SB203580作用48 h。将药物处理后的细胞用PBS1次,每孔加入1 mLDMEM稀释的10 μmol/L DCFH-DA37 ℃避光孵育45 min,收集细胞,用PBS洗,胰酶消化,合并PBS与消化液于离心管,离心弃尽上清后,每个样品加入500 μL PBS重悬细胞,用流式细胞仪检测,每个样品计数1×104个细胞。

2.6  Western blotting法检测蛋白表达

取对数生长期的MCF-7细胞接种于75 mL培养瓶中,培养24 h后,换成新鲜的DMEM培养液,同时加入30 μmol/LBAK或提前1 h加入Tiron,继续培养12243648 h。收集细胞,冰浴裂解,离心后取上清,得细胞总蛋白,加入5×上样缓冲液,混匀后沸水浴使蛋白变性。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,上样,SDS-PAGE电泳后,100 V恒压湿转23 h,用含5%脱脂奶粉的PBS封闭2 h,加入一抗β-actin13 000)、Caspase-31200)、p531500)、p-p531500)、p211500)、Cyclin A21500)、Cyclin B11500)、Cyclin D11500)、CDK21500)、CDK41100)、cdc21500)、JNK1500)、p-JNK1200)、p381500)、p-p38MAPK1500),4 ℃孵育过夜。PBS3次,每次10 min,用Tris-NaCl1次,10 min,根据一抗的来源选择合适的辣根过氧化物酶标记的二抗(15 000),室温孵育2.5hTris-NaCl3次,每次10 minECL化学发光显色,X射线胶片曝光

2.7  统计学方法

所有数据以表示,采用SPSS 17.0进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析。

3  结果

3.1  BAKMCF-7细胞增殖的影响

结果如图1所示,BAKMCF-7细胞的增殖抑制作用具有时间和剂量依赖性,48 h的半数抑制浓度(IC50)值为30 μmol/L。与5-FU相比,BAKMCF-7细胞具有更明显的增殖抑制作用。

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3.2  BAKMCF-7细胞凋亡的影响

为了证实BAK是否以诱导细胞凋亡的方式引起MCF-7细胞的增殖抑制,采用AO荧光染色观察细胞核的形态变化。如图2所示,未经过BAK处理的细胞核染色均匀,细胞壁完整。BAK处理后,细胞核并没有发生凋亡应有的形态学特征,如染色致密、形成凋亡小体等。

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3.3  BAKMCF-7细胞周期的影响

釆用PI荧光染色结合流式细胞术,分析BAKMCF-7细胞周期的影响。如图3所示,对照组S期细胞比例为9.28%30 μmol/L BAK作用12243648 hS期细胞比例分别升高至10.84%18.30%19.30%28.00%。当100 μmol/L ROS清除剂Tiron预处理1 hBAK作用48 h后,S期细胞比例则降为9.59%。以上结果表明,BAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制主要表现为S期阻滞,且ROS在此过程中发挥促进作用。

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3.4  BAKMCF-7细胞ROS产生的影响

为了研究BAK是否能诱导MCF-7细胞产生ROS,利用DCFH-DA荧光染色法测定细胞内ROS的生成量。如图4-A所示,BAK作用细胞012243648 h后,其ROS的生成量分别为3.36%46.20%49.73%56.67%66.67%。特别是BAK作用细胞12 h时,ROS的生成量明显升高,且随着作用时间的延长逐渐增加。而ROS清除剂Tiron预处理1 h后,ROS的生成量降低至33.55%,与BAK 48 h组比较显著降低(P0.01)。以上结果表明BAK可时间依赖性地诱导MCF-7细胞产生ROS

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为了确定ROSBAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制中的作用,引入了ROS的清除剂Tiron考察BAK对细胞增殖的影响。结果显示(图4-B),单独加入30 μmol/L BAK处理MCF-7细胞48 h后,细胞增殖抑制率为58.95%,而提前加入100 μmol/LTiron作用1 h,再加入30 μmol/L BAK共孵育48 h,增殖抑制率则降为35.62%P0.01)。综合上述实验结果表明ROSBAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制中发挥促进作用。

3.5  BAKMCF-7细胞MAPKs通路相关蛋白表达的影响

为了探究BAK是否通过MAPKs通路发挥其对MCF-7细胞生长抑制作用,采用MTT法考察MAPKs通路抑制剂对BAK引起的MCF-7细胞生长抑制作用的影响。结果如图5所示,单独加入BAK时,细胞生长抑制率为69.83%,而分别加入JNK抑制剂SP600125 0.25 μmol/Lp38抑制剂SB203580 0.5 μmol/LERK抑制剂PD98059 2 μmol/L共同作用细胞48 h后,细胞生长抑制率分别为50.66%55.55%67.95%。表明SP600125SB203580可以显著逆转BAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制,而PD98059无影响,提示JNKp38参与BAK诱导的MCF-7细胞增殖抑制过程。

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同时,采用Westernblotting法检测了p38p-p38JNKp-JNK蛋白表达情况。结果如图6所示,随着BAK作用时间的增加,p38JNK蛋白表达水平没有明显变化,活性形式的p-JNKp-p38的表达水平逐渐升高,且具有显著的时间依赖性,而加入ROS清除剂Tiron后,p-JNKp-p38蛋白表达水平并没有下降。表明BAK通过JNKp38途径发挥MCF-7细胞增殖抑制作用,但ROS不参与BAKJNKp38的活化。

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3.6  BAK通过p38 MAPK通路对MCF-7细胞ROS产生的影响

为了研究p38MAPK通路与BAK诱导的MCF-7细胞ROS产生之间的关系,30 μmol/L BAK作用于MCF-7细胞48 h,或提前加入0.25μmol/L SP6001250.5 μmol/L SB203580作用1 h后,再加入30 μmol/L BAK共孵育48 h,采用DCFH-DA荧光染色法检测细胞内ROS的生成量。如图7所示,单加BAK时,ROS的生成量为44.93%,而提前1h加入SB203580时,ROS生成量降为35.97%,差异显著(P0.05)。而与SP600125共孵育时,ROS生成量没有明显变化,说明BAK通过p38 MAPK途径而非JNK途径诱导MCF-7细胞产生ROS

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3.7  BAK通过诱导ROS产生MCF-7细胞周期蛋白表达的影响

如图8所示,随着BAK作用时间的延长,p-p53p21蛋白表达水平上升(P0.050.01),且呈时间依赖性,而加入ROS清除剂Tiron后表达水平降低(P0.01)。结果表明,BAK诱导细胞产生ROS,进而上调p53蛋白表达量并使其活化,激活其下游靶蛋白p21,使其表达水平升高。

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进一步检测S期主要调节蛋白CyclinA2CDK2的表达量及G0/G1G2/M期相关蛋白表达水平。结果如图8所示,随着BAK作用时间的增加,CyclinA2CDK2表达水平降低(P0.050.01),且呈时间依赖性,而加入ROS清除剂Tiron后,CyclinA2CDK2蛋白表达水平升高(P0.050.01)。而G0/G1期和G2/M期相关蛋白表达量均没有明显变化。结果表明,BAK可通过诱导ROS的产生下调S期相关调节蛋白CyclinA2CDK2表达水平。

 

4  讨论

乳腺癌是一种女性最常见的恶性肿瘤[10]。近年来,中药来源的活性化合物已逐渐成为新型抗乳腺癌药物的重要来源。本研究发现中药补骨脂主要成分BAK呈时间、剂量依赖性地抑制MCF-7细胞增殖,且其抑制作用明显强于临床常用抗肿瘤药物5-FU。进一步研究发现,BAK并未引起MCF-7细胞发生细胞核固缩或碎裂等凋亡现象,且BAK处理后G1期细胞比例较低,说明BAK不能诱导MCF-7细胞发生凋亡。然而,BAK可以呈时间依赖性地上调S期细胞比例,提示BAK通过诱导MCF-7细胞发生S期阻滞,进而抑制细胞增殖。

细胞周期阻滞是一种有利于机体的保护机制,当细胞受到外界环境刺激发生DNA损伤时,可通过几个细胞周期监测点的调节来启动细胞周期延迟或阻滞,以便于DNA修复。细胞周期主要分为G0/G1SG2/M期,在细胞受到生长因子或其他因子刺激时,细胞从G0期(静止期)退出,进入G1期(活跃期),然后再进入S期,在S期时,DNA的合成发生。S期阻滞在大多数癌症发病机制中起了重要的作用[11]。在S期阻滞过程中,一些相关的信号通路被激活,从而引发细胞死亡级联反应和增殖抑制[12]Yang[13]证实赭曲毒素A通过下调CyclinA2CDK2的表达,进而诱导人胚胎肾细胞发生S期阻滞。Tu[14]也发现辛伐他汀通过Chk1- cdc25A-cyclinA/CDK2途径诱导多发性骨髓瘤细胞发生S期阻滞。本研究发现,BAK也可以通过下调CyclinA2CDK2的表达进而诱导MCF-7细胞发生S期阻滞。

MAPKs是在响应胞外刺激时的一个重要的信号通路,主要包含3个主要家族:ERKJNKp38MAPK。研究表明,MAPKs信号通路能够调控细胞周期[15]。在乳腺癌中,p38 MAPK作为一个中心激酶在乳腺癌侵袭和转移中也起到至关重要的作用[16]。本研究发现,加入JNK抑制剂SP600125p38MAPK抑制剂SB203580时,BAKMCF-7细胞的增殖抑制作用减弱,而加入ERK抑制剂PD98059时,BAKMCF-7细胞的增殖抑制作用无任何影响,说明BAK是通过JNKp38MAPK途径诱导MCF-7细胞发生增殖抑制(图9)。

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ROS主要以超氧离子(O)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH)等形式存在,在应对各种的胞内和胞外刺激时,ROS被认为是重要的可以决定细胞命运的分子之一[17]。大量研究表明,细胞内ROS过量生成可造成细胞增殖抑制。在本研究中,BAK可诱导MCF-7细胞产生ROS,并引起S期阻滞,当加入ROS清除剂Tiron后,ROS生成量降低,且S期阻滞现象被逆转。当加入p38MAPK抑制剂SB203580后,ROS生成量降低,且Western blotting分析也显示加入ROS清除剂Tiron后,不能逆转p38MAPK的表达,以上结果表明,p38MAPKROS的上游,即BAK先激活p38MAPK,进而引起ROS的生成,从而使MCF-7细胞阻滞于S期。本研究中,JNK可以诱导MCF-7发生增殖抑制,但当加入JNK抑制剂SP600125后,ROS生成量没有逆转,说明JNK没有通过ROS的产生发挥增殖抑制作用,具体机制有待进一步研究。

细胞增殖是细胞生命活动的基本特征之一,也是生物有机体的重要特点。在胚胎发育的早期细胞以惊人的速度进行分裂,细胞分裂后紧接着进行DNA复制[18]。在细胞周期分裂增殖的过程中,周期蛋白Cyclin和周期蛋白依赖性激酶CDK起着重要的调控作用[19]CyclinA2/CDK2复合物在S期调控特别是在DNA合成过程中起到非常重要的作用[12]p53是一种转录因子,在细胞对外界的应激反应中充当重要角色。p53基因是一种抑癌基因,可通过调节一些基因的表达引起细胞周期阻断和细胞凋亡,明显抑制肿瘤细胞的生长,p53可以调控p21的表达,p21能够与CyclinA2/CDK2结合从而抑制其活性[20]。本研究中,Western blotting结果显示,BAK可时间依赖性地上调p-p53p21蛋白的表达水平,下调CyclinA2CDK2蛋白的表达水平。加入活性氧清除剂Tiron之后,其蛋白的表达水平都得到逆转,而G0/G1期和G2/M期的相关蛋白表达并没有随着BAK作用时间的增加而改变。可见,BAK是通过诱导ROS的产生,进而激活p53,然后增加p21的表达,又下调CyclinA2CDK2蛋白的表达,降低CyclinA2/CDK2复合物的表达,最终造成MCF-7细胞发生S期阻滞。

综上所述,BAK可以明显抑制MCF-7细胞增殖。其可通过p38-ROS-p53途径诱导MCF-7细胞发生S期阻滞,此外,BAK通过JNK但不通过ROS途径抑制细胞增殖。本研究为BAK抗乳腺癌的深入研究及临床应用提供理论依据。

参考文献(略) 
来  源:张哲楠,邱琬婷,曹世杰. 补骨脂酚诱导人乳腺癌MCF-7细胞S期周期阻滞及机制研究 [J]. 中草药, 2020, 51(3):702-709.
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