1. sci666首页
  2. 实用技巧
  3. 基础实验

细胞培养方法(四):细胞的冻存

细胞的冻存

目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高,pH值改变,部分蛋白质由于上述原因而变性,引起细胞内部空间结构紊乱,溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶,使细胞内结构成分造成破坏,线粒体肿胀,功能丢失,并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变,使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多,随冷冻温度的降低,冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤,而致细胞死亡。

因此,细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。通常采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂,这两种物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性,且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而减少冰晶对细胞的损伤。

1所需材料
· 超低温冰箱或液氮罐

· 0.25%胰蛋白酶

· 含10%~20%的血清培养液

· DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)

· 2mL专用细胞冻存管

· 吸管、离心管、喷灯、冻存管架

2贴壁细胞的冻存

1. 选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉,用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶,加入等量完全培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min,5分钟)。

2. 去上清液,加入含20%小牛血清的完全培养基,于4℃预冷15分钟后,加入10%的DMSO,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3×106~1×107/mL之间。

3. 将上述细胞分装于冻存管中,将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻存日期,同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。

4. 先将冻存管置入置于4℃/30 min,再转入-20℃/2-h后,再放入-80℃冰箱冷冻过夜,次日保存到液氮罐中。

注:细胞冻存在液氮中可以长期保存,但为妥善起见,冻存半年后,最好取出一支冻存管的细胞复苏培养,观察生长情况,然后再继续冻存。

3悬浮细胞的冻存

1. 直接将细胞收集到离心管

2. 1000rpm离心5min,弃上清

3. 以生长培养基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清重悬细胞至终浓度约107/ml,加入10%的DMSO。

4. 以每管1ml分装至冻存管中。

5. 置于4℃/30 min,再转入-20℃ 2h后,再放入-80℃冰箱冷冻过夜,次日保存到液氮罐中。

4液氮罐使用注意事项

1. 初次使用前检查容器内胆是否清洁干燥,外部有无凹陷及严重碰伤,如有轻微凹陷及碰伤,经试验其蒸发性能不变,仍可继续使用,如性能下降,应停止使用,避免经济损失。

2. 液氮容器应放在阴凉干燥处,应有良好的通风,不应放置在靠近热源,阳光直照,以及风口处,严禁放置液氮容器的房间紧闭门窗,以免室内因液氮蒸发使氧气含量下降,造成呼吸困难。

3. 只能用于充装液氮,冻存细胞和病毒用,严禁充装液氧等易燃易爆及腐蚀性液体,以免产生猛烈燃烧、爆炸或对容器产生腐蚀。

4.液氮是超低温液体(-196℃),在充装时,要穿长袖工作服、带皮手套,以避免液氮飞溅造成冻伤。

5.贮存容器不得作贮运容器使用。若运输液氮。必须使用B型贮运容器。因此类容器有特殊支撑结构,坚固可靠不易损坏。

6. 液氮容器在使用过程中,每天都应随时检查容器的使用情况,如发现容器瓶盖上和上部有水珠或结霜情况,说明容器质量出现问题,应立即停止使用。

7.存入取出样品要标记,拿取东西要轻拿轻放。

这些可能会帮助到你: 问答社区 | 共享百度SVIP | 留言建议

欢迎入群交流:生信分析群: 732179952 · Meta分析群: 797345521

发表评论

登录后才能评论