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细胞培养经验总结

我养细胞有 8 年历史了,现在我的细胞已成为大家参观和崇拜、学习的对象。好的经验要分享,这就将我这几年来养细胞的经历和感想跟大家交流一下。

启蒙老师的重要性

一般进实验室都有师兄师姐带着做,他们就是你做细胞的启蒙老师。他们的操作手法、细节、理论讲解就成了你操作的准则,如营养液、细胞瓶的摆放位置;灭菌处理程序;开盖手法;细胞吹打手法等等。要学会他们的正确操作,在第一次的时候就要重视。

像养孩子一样养细胞

细胞真的很脆弱,最好每天都去看看它,以防止出现培养箱缺水、缺二氧化碳、停电、温度不够等异常现象,也好及时解决这些意外,避免重复实验带来的更大痛苦。

好细胞要及时保种

 

细胞要分批传代,这样即使有一批出了问题,还有一批备用的。像后者一般人可能不容易做到。但这是我血的教训,有一次细胞污染了,全军覆没。当时可后悔没有保种。

每种细胞都有自己的特性,要区别对待。

细胞跟人一样,不同的细胞,培养特性是不一样的。培养过程中要细细体会。不同细胞株使用不同的培养基和血清。

如我养的平滑肌细胞很活跃,喜欢热闹,2~3 天就好多人口,而且不太爱吃喝,真是最好养的孩子了。内皮细胞和平滑肌细胞性格相近,不过它很不讲卫生,也很邋遢,里面有很多分泌屋,要经常换洗才行。RAW264.7 细胞也很开朗,而且很能吃,要经常喂它,头疼的是细胞很容易活化,培养它的瓶子和环境没有内毒素才好,不过我这个当妈的很难满足它了。

培养前的工作准备充分

包括耗材的处理、试剂的配置,无菌检验等等。

  • 玻璃器皿的清洗。对于玻璃器皿(细胞瓶、装营养液的瓶子、小青霉素瓶等)要先用洗衣粉刷干净(注意死角),然后冲干净。用酸液浸泡 24 h 以上,之后用清水冲洗 10 遍,除去残留酸液。瓶子之类,冲洗过程要使劲摇晃。然后在双蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎,160℃ 干烤 2 h 待用。

  • 试剂配置。细胞培养用的液体一般使用双蒸以上的水即可。并注意 pH 值的调节。

  • 无菌检验。主要采用过滤除菌:如胰酶、抗生素、G-418 溶液、各类培养基、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。有些可以采用高压灭菌:如 PBS、D-Hank’s等。

试剂分装保存

包括营养液、胰酶、血清等。

血清特别重要。血清必须贮存于 –20℃,如果一次无法用完一瓶,可将 40~50ml 分装于无菌酸处理瓶中,甚至置青霉素瓶保存。一般厂商提供的血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。(一般情况下不影响细胞培养)

瓶装血清一定要逐步解冻: 4℃ 冰箱全溶后再分装,在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

热灭活是指 56℃,30 分钟加热已完全解冻之血清。水浴锅升到 56后,将血清放入,待温度升高到 56℃ 后计时,一般 5 分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须,一般不要作此热处理,因为会造成沉淀物之显著增多,且会影响血清之品质。注意更换新血清(包括不同批次)对细胞的影响。

无菌意识要强

实验进行前,超净台以紫外灯照射 30 分钟灭菌,以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启超净工作台风扇运转数分钟后,才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。

无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置,其它个人实验用品用完应立即拿出。实验用品以 70% 乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域,一般勿在边缘区域操作。

小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约 45° 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

选择正确的培养基

 

不同的细胞可能培养基不同,甚至不同的文献可能对相同的细胞培养基成分也是可能不同的。如我当时培养神经干细胞,有文献就选用 neurobase 培养基,而我的实验目的主要是做抗氧化和氧化方面的,而这种培养基中含有抗氧化剂成分,此时,我就不得不选择另外一种不含抗氧化剂的培养基。

这些是我的培养经验的,那么你的呢?

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