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荧光定量PCR的实验设计和体系优化

引物设计原则

SYBR Green I方法引物设计标准

  1. 引物长度17~25mers;
  2. GC含量40%~60%;
  3. 一对引物的Tm不能相差太大,尽量避免超过2℃;
  4. 避免引物自身或一对引物之间形成4个或4个以上连续配对;
  5. 避免引物自身形成环状发卡结构;
  6. 引物的3’端碱基最好为G或C,尽量避免3’端碱基为T;
  7. 目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致,不大于300bp,有利于使两种基因扩增效率相同。

TaqMan方法探针设计标准

  1. 探针应尽可能靠近扩增引物,但不能与引物重叠;
  2. 长度一般为18~40mer;
  3. GC含量控制在40%~80%;
  4. Tm值为70℃左右最为合适;
  5. 探针的5’端应避免使用G碱基,其会淬灭荧光,导致检测失败;
  6. 在整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量,因为G会降低扩增效率;
  7. PCR产物长度最好在150bp以下;
  8. 探针的Tm要比引物高出5℃,以保证探针与模板结合的稳定程度大于引物与模板的结合。

Real-time PCR实验体系

反应体系:

物质 体积
2x SYBR Green I Mix 10μL
上下游引物(10μmol/L) 0.4μL
Rox 0.4μL
模板 1~2μL
RNase-free水 至20μL

Rox染料

在Real-time qPCR的反应过程中,由于不同反应孔中反应液体积的微量差别、qPCR管的内在差异、以及反应进行中的随机因素等,会导致不同反应孔的荧光信号出现差异,因此向每个反应孔中加入等量的Rox染料,其作用包括:

  1. 校正单次反应中由于泡沫或蒸发而导致的信号改变;
  2. 均一化校正由于移液物差导致的批内体积差异;
  3. 均一化校正批间体积差异,提供更连续一致的批间重复Ct值。

目前共有两种Rox被投入使用,不同型号的Real-time qPCR仪所用Rox各不相同,根据所有试剂的说明书选择准确的Rox,如果所加的Rox与仪器要求不符,则会导致Real-time qPCR实验的失败。

反应体系配制注意事项

Real-time qPCR的整个操作要在冰上进行,以防止PCR反应的提前开始和模板的降解。

除了模板外的反应体系统一配制,之后分别加入到8连管或96孔板中对应的反应孔中,配制时需要多配制3-5个反应所需体系,以防最后向反应孔中添加时不够。

添加模板时要注意枪头中的液体是否完全推净,并频繁更换枪头,以减少由于操作带来的误差。

每个样品对于每个目的基因同时进行3次重复的Real-time qPCR反应,同时还要进行以无菌水作为模板的阴性对照

反应条件:

  1. 预变性:95℃,5min;
  2. 扩增:95℃,30s;55℃,30s;72℃,30s;40个循环;
  3. 熔解曲线:起始温度60℃,终止温度95℃,温度变化速率为0.1℃。

融解曲线

在SYBR Green I 染料法中用于确定PCR产物的特异性,当PCR反应结束时,从50℃一直加热到95℃,在此过程中PCR产物按照Tm值的大小双链被依次打开,荧光强度也随着双链的打开依次减弱,从而得到溶解曲线。

荧光定量PCR的实验设计和体系优化

融解曲线为单峰则证明PCR反应没有出现非特异性产物

实验方案的优化

Mg2+的浓度

Mg2+的浓度是影响Taq酶活性的关键因素,Mg2+浓度过低可影响Taq酶最佳活性的发挥,Mg2+浓度过高,会增加非特异性扩增

一般来说,以DNA或cDNA为模板的Real-time qPCR反应,应选择2~5mmol/L的Mg2+浓度,以mRNA为模板直接进行的反应,应选择浓度为4~8mmol/L

模板的质量和浓度

模板的浓度应根据Ct值进行选择,一般而言,使Ct值位于15~30个循环之间比较合适,若大于30则应使用较高的模板浓度,如果Ct值小于15,则应降低模板浓度,如果研究者是进行首次实验,那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验,以选出最为合适的模板浓度。

PCR抑制

对于一些成分复杂样本(土壤、沉积物等)的Real-time qPCR反应,此时提取的DNA模板中通常含有较多的腐殖质等物质,其会抑制PCR反应,导致扩增效率下降,从而使对目的基因的定量准确性降低

通常采用用对DNA模板进行稀释的方法消除PCR抑制,但是某些情况下,由于模板量较少,稀释的办法并不适合,就需要对模板进行额外的纯化。

引物浓度和纯度

引物浓度太低会致使反应不完全,若引物浓度太高,则发生错配,并产生非特异性的扩增产物。对于大多数PCR反应,0.5μmol/L是适宜的引物浓度,若初次实验结果并不理想,可在0.3~1.0μmol/L之间进行调整。

Real-Time qPCR所用引物的纯度至少要达到PAGE级,如使用OPC级引物会造成结果的不准确。

引物二聚体

荧光定量PCR的实验设计和体系优化

通常目的基因PCR产物熔解曲线的峰出现在80~90℃之间,当熔解曲线在70~80℃范围内出现一个荧光强度较小的峰时,表明Real-time qPCR反应有引物二聚体生成。

此时首先要判断引物二聚体产生的原因,如果在高目的基因拷贝样品中没有出现引物二聚体,而只在低目的基因拷贝样品中存在引物二聚体,此时引物二聚体的出现是由于样品中目的基因含量过低,导致引物过量而发生自我匹配,可以通过增加模板使用量或减少引物使用量的方式消除引物二聚体。

另一种消除引物二聚体的方式是提高退火温度,但是并不是一定有效,建议在进行Real-time qPCR之前最好通过温度梯度PCR的方式检验引物是否会形成二聚体,同时确定合适的退火温度。

扩增效率

在绘制目的基因标准曲线时,经常会遇到扩增效率偏差较大的问题。

可以在反应体系中添加500μg/mL的BSA(牛血清蛋白),BSA能够稳定低浓度的核酸模板,同时提高扩增效率

短的PCR产物比长的PCR产物扩增效率高,这是因为短的产物在95℃时更易变性,使引物和探针在退火阶段更有效地与其互补序列结合,降低来源于基因组扩增的污染,同时缩短了扩增时间。

提高退火温度可以提高PCR反应的特异性和扩增效率,必要时可以将退火温度提高至60℃以上,并去除72℃的延伸阶段,将退火和延伸合并为一个阶段进行,以保证目的基因的扩增效率。

如标准曲线的扩增效率高于100%较多,多数是由于标准品梯度稀释过程中操作失误,导致稀释倍数较多的低浓度标准品不准确,应重新对标准品进行稀释后再次绘制标准曲线。

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