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  2. 实用技巧
  3. 基础实验

MTT法测细胞增殖和药物毒性实验protocol

1.原理

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(即OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强(如果是测药物毒性,则表示药物毒性越小)。

2.试剂及耗材

CO2细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜 、低速离心机、酶标仪、8道排枪、培养基 、胎牛血清 、MTT、 DMSO、96孔细胞培养板、胰酶、血细胞计数板等。

3.注意事项

(01)选择适当细胞接种浓度和培养时间。

(02)设置调零孔(只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul)。

(03)设置空白孔(细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亚砜)。

(04)MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系。

(05)96孔板边缘32孔用无菌PBS填充,因为边缘的32孔中水分蒸发很快,药物易被浓缩,对实验影响大。同时加入PBS液填充后,可以一定程度上保持中间孔的水分。

(06)防止药物与MTT反应。如果96孔板中加入了具有氧化还原性的药物,比如谷胱甘肽、Vit E、VitC,那建议用PBS将细胞洗洗,否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀,这种效果可能是不需要的。

(07)吸收值分析。在理想的MTT实验中,如果是细胞抑制实验,不加药物处理的空白组的吸收值应该在0.8-1.2左右,太小检测误差占的比例较多,太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。

(08)培养过程中换液。100ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持50h以上,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果。如果培养时间长,在48h应该换液一次。

(09)避免血清干扰。高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。

(10)判断污染。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大。在加MTT前可以先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的。

(11)加DMSO前要把液体小心吸掉。但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96孔板,2000r,5分钟,然后吸掉上清(如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉。对于贴壁细胞,可以试着将96孔板倾斜30度角,然后用枪尖慢慢吸。

(12)MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配,0.22μm过滤后4℃避光保存两周内,或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存,避免反复冻融,小剂量分装,用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解,当MTT变为灰绿色时不能再用。一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。

4.实验步骤:

4.1 细胞标准曲线制作

(1) 0.5%的胰酶消化对数期细胞,待细胞即将脱离皿底时,加少量血清终止反应,1000r/min,离心5min,吸去上清,将细胞沉淀用培养基吹打混匀,制成细胞悬液,细胞计数后调整其浓度至5-10×10^4/ml。

(2)取4块96孔板,分别标记为0h、24h、48h、72h,,每组设置3个复孔,每孔加入100 μL细胞悬液,每板分别铺8组细胞,分别为3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔,边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应。

(3)5%CO2,37℃培养箱继续培养,每24 h取出一块96孔板检测:

a) 每孔加入10 μL MTT溶液(5mg/ml),继续细胞培养箱培养4-6h;

b) 小心吸去孔内培养液(用移液器吸取孔内培养液,吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取,不要触碰底部的紫色结晶。或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液);

c) 每孔加入150μL DMSO,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解(加入 DMSO 溶解后,将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10~20 min,这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解(尤其在冬天));

d) 加DMSO后10min内,用酶标仪检测各孔波长μl570nm的吸光值;

(4) 标准曲线制作

以时间为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线。选择合适的细胞浓度进行实验。

4.2 MTT药物毒性实验步骤

(1)0.5%的胰酶消化对数期细胞,加少量血清终止反应,1000r/min,离心5min,吸去上清,将细胞沉淀用培养基吹打混匀,制成细胞悬液,细胞计数后调整其浓度至5-10×104/ml,药物毒性实验一般每孔细胞数量5000—10000个(具体数目根据预实验判断)。此外,还应根据细胞本身特性,如生长快慢,来决定细胞数量。比如:生长较快的细胞密度可略小。下面是几种常见的细胞接种数量(来源于网络,仅供参考)。

 

(2)将细胞悬液制备好后,轻轻混匀,每孔加入90μl细胞悬液, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

注意:因细胞在混匀后仍要继续沉降,因此接种的过程中要反复多次混匀,如每加5个孔就混匀一次,以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同,这对于MTT的结果至关重要。

(3)5%CO2,37℃培养箱继续培养,待细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物。(原则上,细胞贴壁后即可加药,或两h,或半天时间,但我们实验室常在前一天下午铺板,次日上午加药。加药时按照所需的浓度在EP管中先稀释好,每孔加入10μl已经稀释好药物,使每孔最终体积为100μl,为了避免产生误差,稀释好的药物体积应略大于所需药物的体积。需要注意的是,以DMSO 作为溶剂溶解的药物至少需要进行100倍以上稀释才能使用,因为作用于细胞DMSO的含量高于1%时,DMSO会杀死细胞从而影响判断。

(4)按照药物作用时间点,每24 h取出一块96孔板检测:

a) 每孔加入10 μL MTT溶液(5mg/ml),继续细胞培养箱培养4-6h;

b) 小心吸去孔内培养液(用移液器吸取孔内培养液,吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取,不要触碰底部的紫色结晶。或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液);

c) 每孔加入150μL DMSO,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解(加入 DMSO 溶解后,将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10~20 min,这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解(尤其在冬天));

d) 加DMSO后10min内,用酶标仪检测各孔波长490nm的吸光值(有用570nm的);

(5)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

(6)MTT结果分析

关于如何计算IC50,使用改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大剂量

I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

Pm:最大阳性反应率

Pn:最小阳性反应率

举个例子:各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下:

MTT法测细胞增殖和药物毒性实验protocol

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值,如对于100ug/ml的药物,其抑制率=1-0.080/0.614=0.869,各组抑制率如下:

MTT法测细胞增殖和药物毒性实验protocol

代入计算公式:

Pm=0.869
Pn=0.135
P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142
Xm=lg100=2
lgI=lg100/50=0.301
lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655
IC50=45.186

该药物的IC50值为45.186ug/ml,IC50值也可以通过Graphpad prism7进行计算,具体可参考文章:

https://jingyan.baidu.com/article/fd8044fa19f4065030137a60.html

https://www.graphpad.com/guides/prism/7/curve-fitting/index.htm?reg_dr_inhibit_variable.htm

4.3 MTT增殖实验

(1)分别收集各组对数期的细胞,调整细胞悬液浓度;

(2)取4块96孔板,每孔加入100 μL细胞悬液,铺板使待测细胞为5×10^3 cell/孔(边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应),每组设置3个复孔;

(3)5%CO2,37℃培养箱继续培养,每24 h取出一块96孔板检测:

a) 每孔加入20 μL MTT溶液(5mg/ml),继续细胞培养箱培养4h;

b) 小心吸去孔内培养液(用移液器吸取孔内培养液,吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取,不要触碰底部的紫色结晶。或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液);

c) 每孔加入150μL DMSO,使结晶物充分溶解(加入 DMSO 溶解后,将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10~20 min,这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解(尤其在冬天));

d) 加DMSO后10min内,用酶标仪检测各孔波长490nm的吸光值(有用570nm的)。

(4)数据处理及MTT增殖曲线绘制。

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