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Western blot操作指南及常见问题

蛋白免疫印迹即Western blot,是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

具体实验操作过程如下:

Western blot操作指南及常见问题
 
操作WB实验,是需要段位晋级的,青铜阶段的你经常会出现以下一些情况:
1、“啥也没有”
分析原因:比较多,如果单纯一张没有显色的X光片,可能是一抗或者二抗加错了,故操作过程中要仔细检查抗体是否加错,确认转膜没有问题;
2、“高背景”
高背景可能是WB实验中最常见的问题,目的条带单一清晰,但其他地方又出现连续的、均一的背景;
分析原因:封闭没做好,一抗浓度高,洗膜时间和次数不够,洗膜:8min*5次或10min*4次;
3、“非特异性条带”
分析原因:一抗特异性与蛋白结合,建议更换一抗或者降低一抗浓度,才用阴性对照或阳性对照确定正确的目的条带;
4、“条带中出现规则的白圈”
分析原因:电转中膜和胶之间存在气泡,建议仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡,可以左右前后观察,然后在往胶上面浇点电转液,用两只手的拇指和指轻轻夹住PVDF膜的两侧,使膜成U型,然后将U型的底部接触胶的中间,慢慢往两边放下膜,这样一般气泡很少;
5、“出现黑点或黑斑”
分析原因:膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合,建议封闭结束后要洗三遍再加一抗;
6、“条带拖尾”
分析原因“蛋白量太大,一抗浓度太高或作用时间太长,所以洗一抗和二抗是千万不要偷工减料;
7、“出现重影”
分析原因:荧光强度较高,或者在压片时,放好后又不小心移动了一段距离;
8、“条带呈哑铃状”
分析原因:配置胶有问题,胶凝固后不均一;
9、其他
①出现纵向纹理,可能是上样样品中出现不溶颗粒;
②在分离胶中跑不动,可能忘记加SDS;
③条带两边向上,可能是凝胶冷却不均一或者电泳槽老化造成;
④条带中间向上凸起,可能是凝胶左右两头没有凝固好;

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