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Western Blot技术系列讲解之灌胶技术

学习Western Blot技术,首先要学习的就是手灌胶技术。手灌胶技术是WB实验中最基本的技术,虽然现在预制胶横行天下,但是对于某些特定蛋白或比较极端分子量的蛋白,预制胶达不到好的分离效果,有些表达量极低的蛋白预制胶胶孔达不到足够上样量,这时候我们就需要根据待分离蛋白的特性来配制聚丙烯酰胺凝胶,今天我们就介绍一下手灌胶技术。

Western Blot技术系列讲解之灌胶技术

(1)手灌胶各成分介绍;

a.丙烯酰胺:形成聚丙烯酰胺的基本物质,具有神经毒性及致癌性(WB所用试剂几乎都具有强毒性,做好实验的前提,先要保护好自己);

b.Tris-Hcl:在蛋白电泳中与Gly构成缓冲体系,稳定电泳过程中的PH稳定,Tris(氨丁三醇)可致癌;

c.过硫酸铵(AP):相当于催化剂作用,提供两种丙烯酰胺聚合所必须的自由基;

d.TEMED(四甲基二乙胺):催化过硫酸铵产生自由基,从而引发聚合反应,促进聚丙烯酰胺凝胶形成(凝固剂),具有强烈刺激性气味(恶臭),并具强神经毒性;

e.SDS(十二烷基硫酸钠):能使蛋白变性,具有呼吸刺激性。

(2)常用分离胶浓度与最佳分离范围;

分离胶浓度 最佳分离范围(kD)
6% 50—150/60-220
8% 30—90
10% 20—80
12% 12—60
15% 10–40

备注:分离胶浓度越大,最佳分离蛋白分子量越小。

(3)分离胶配制(两块胶量—10ml);

成分 分离胶浓度
6% 8% 10% 12% 15%
超纯水 5.3ml 4.6ml 4ml 3.3ml 2.3ml
30%丙烯酰胺 2ml 2.7ml 3.3ml 4ml 5ml
1.5M Tris(PH8.8) 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml
10%SDS 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl
10%AP 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl
TEMED 4μl 4μl 4μl 4μl 4μl

备注:我们所说的胶浓度,实际是指丙烯酰胺浓度。

(4)浓缩胶配制:

成分 4ml量 6ml量
超纯水 2.7ml 4.1ml
30%丙烯酰胺 660μl 1.0ml
1.5M Tris(PH6.8) 500μl 750μl
10%SDS 40μl 60μl
10%AP 40μl 60μl
TEMED 4μl 6μl

备注:浓缩胶一般使用2—3ml即可,浓度一般使用5%。

(5)聚丙烯酰胺凝胶配制:

a.检漏,选取清洗干净的模具玻璃,固定于胶固定器上,加入超纯水,检查模具是否漏液;

b.配制分离胶,按所需浓度配制分离胶,配制过程中最后加入TEMED,混匀后灌入模具,防止产生气泡,并注意高度,最后轻轻加入超纯水封口,使液面平整,凝固速度受室温影响,温度越高,凝固越快,冬天可放入孵箱中加速凝固;

c.待水和胶之间出现一道折线时,说明胶已凝固,此时,将水倒出,并用吸水纸吸干残余水分;

d.浓缩胶配制,按需量配制浓缩胶,同样最后加入TEMED,灌入分离胶上面,灌满模具,排气泡后插入所需梳子,待胶凝固。

胶一般提前一天配制,配制完成后,可泡到电泳液中,存放于4℃冰箱保存,第二天使用。

总之,手灌胶技术是WB的基础入门级技术,相对于昂贵的预制胶(特别是赛某某,涨价涨得没法做实验了),手灌胶性价比更高,对某些蛋白分离效果也更好。系统的掌握WB技术,依赖于预制胶还远远不够,预制胶虽然节省了配胶的时间,但还是有特殊蛋白需要手灌胶进行分离。

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