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细胞培养技术之 细胞传代

细胞培养技术(二) 细胞传代
什么是细胞传代?
细胞传代即去除原培养基并将细胞从原培养体系转移到新鲜的生长培养基中,该过程可使细胞系或细胞株进一步增殖。

接种后培养细胞的生长将从延滞期进入对数期,即:细胞呈指数增殖。当贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间,或者悬浮培养的细胞已超过培养基所能支撑的能力,无法进一步生长时,细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止 (参见下图)。为了将细胞密度维持在最佳水平,以便细胞继续生长,并且刺激其进一步增殖,必须将培养物分成若干部分,并添加新鲜培养基。

细胞培养技术之 细胞传代

细胞贴壁过程
细胞培养技术之 细胞传代

何时传代?
对于贴壁培养和悬浮培养而言,判断是否需要传代的标准大致相同。

细胞密度贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代。正常细胞达到汇合状态时会停止生长 (接触抑制),重新接种后需要较长时间才能恢复。转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖,但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。类似地,悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时,悬浮培养的细胞会聚集成团块,转动培养瓶时培养基会变得浑浊。

培养基耗竭:生长培养基 pH 值降低通常表示乳酸蓄积,乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸有细胞毒性,而且 pH 值降低也是细胞生长的不利因素。pH 值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度,细胞浓度越高,培养基耗竭的速度越快。如果发现 pH值迅速降低 (> 0.1–0.2 pH 单位),同时细胞浓度增大,则应对细胞进行传代。

传代时间安排
严格按照预定时间进行细胞传代可确保细胞的生物学行为稳定,便于监测其健康状态。从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度,直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量。细胞偏离如此确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳 (例如:变质、污染) 或者培养体系的某一组分功能异常 (例如:未达到最佳温度,培养基过于陈旧)。我们强烈建议您保留详细的细胞培养记录,记录加料和传代时间、所用培养基种类、解离方法、分种率、形态学观察结果、接种浓度、产量和抗生素用法。

最好按照传代时间安排开展实验和其他非常规操作 (如更换培养基种类)。如果您的实验安排与常规传代时间安排不吻合,则应确保当细胞仍处于延滞期或者已经达到汇合状态、停止生长时,不进行传代。

贴壁细胞传代流程
以下实验方案介绍了贴壁细胞和悬浮细胞传代的一般流程。为自己所用的细胞系传代时,建议您严格遵守实验中所有产品附带的操作说明。偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常,甚至培养完全失败。

注意:所有与细胞接触的溶液和设备均应为无菌状态。必须采用正确的无菌技术,并且在层流通风橱内工作。

(1)传代前准备

用具紫外照射消毒(30min):无菌培养瓶,15ml离心管,移液管,移液枪,枪头。

倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

(2)胰蛋白酶/EDTA消化

从培养箱中取出待传代的细胞(将盖子拧紧),75%酒精进行瓶口消毒,吸掉培养细胞的旧培养基,PBS缓冲液洗去残留的旧培养基,按25m2/ml消化液比例加入消化液,消化液中EDTA浓度视不同细胞而定。放入显微镜下观察,待所有细胞变圆后立即拿入超净台内,加入6ml细胞完全培养基中止消化,消化时间为1-5min,具体以细胞而议,采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面,注意吹打全部培养表面,可以按照先左右吹打,后上下吹打的方式,取所有的细胞悬液放入干净的15ml离心管内,每分钟1000rpm,RT5min。

(3)制备细胞悬液及培养

吸取上清液丢弃,不要吸到底部的细胞沉淀,向离心管内的细胞沉淀加入适量完全培养基,吹打混匀,吹打过程中尽量不要产生气泡,以1:2的比例进行分瓶。

(4)结果观察

第二天观察细胞情况,细胞培养换液时间一般2-3天。

(5)注意事项

1 严格无菌

2 适度消化:把握好消化液的最佳浓度

3 吹打细胞动作要轻柔

悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉,只留下少量,然后加入新鲜培养液即可。当细胞悬液中碎片或颗粒物较多,感觉到比较脏时,可以将悬液移到离心管内,1000-1500rpm离心3min,弃上清,加入约2ml培养液,吹打至均匀,滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中,然后置于二氧化碳培养箱中培养。

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