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临床工作忙没时间搞科研?老司机带你全面解析“单细胞转录组测序”

临床工作忙,搞科研没时间?有没有那种把钱丢进去出来一篇文章的研究?单细胞转录组测序了解一下。单细胞测序有许多公司可以做,极大的节约了临床医生的宝贵时间和精力。但是对单细胞测序一无所知,要怎么开展科研工作呢?今天小编带家解开单细胞测序的面纱。

单细胞转录组测序定义

单细胞转录组测序(single cell RNA Seq,scRNA-seq)是指对于单个细胞水平上将mRNA反转录扩增后进行高通量测序的技术。那为什么单细胞测序技术更精确呢?之所以开发单细胞测序技术,是为了避免单个细胞的转录数据被大群体的转录数据所覆盖。

比如我有三个样本,阳性表达都不相同,但是由于群体数据的覆盖,所有的结果都被平均化,所以即使阳性不同的三个样本,最后得到的结果也大致相同。而单细胞测序则可以将每个细胞的转录水平显现出来,通过数据分析可以将每个细胞都分为不同的群体,所以更加精确。

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单细胞转录组应用领域

 

1.人类细胞图谱的构建,可以对人体所有细胞进行测序,就可以得到不同细胞的转录组图谱,并且可以从基因表达中绘制所有细胞以及其空间组织方式。

2.肿瘤异质性研究,可以研究肿瘤的耐药性,愈后变化,深入癌症的发生,发展机理。

3.免疫方向研究,可以研究免疫细胞的异质性,解析不同细胞亚群对病原体入侵时的响应,嘉定不同的免疫细胞类型。

4.发育及分化,可以了解不同组织细胞的异质性,对不同细胞发育过程进行解析,还可以挖掘潜在的特异性分子及探究分子机制。

5.干细胞研究,分析干细胞异质性,探究干细胞潜在的分子标记物,研究干细胞的发与分化机理。

6.胚胎发育研究。可以根据不同的细胞亚群,构建细胞谱系,预测细胞分化方向。

单细胞转录组测序流程

将适当浓度的单细胞悬液,利用含有Barcode和引物的胶珠与细胞,酶混合通过双十字系统包裹在油滴中。流到储液器中被收集,凝胶珠被溶解释放Barcode。通过反转录产生带有Barcode的cDNA,并对从DNA进行扩增反应,纯化后进行检验。之后酶切打断产物,按照二代测序技术的艰苦程序进行文库的构建。构建好文库后就可以送公司进行测序啦。

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需要注意的是测序所用的细胞必须是新鲜细胞悬液,可以来源于组织,血液,或细胞核。但细胞活性必须在90%以上。现在有许多公司为了保证样品的新鲜度,都可以上门进行细胞文库构建工作。

得到测序结果就可以进行生物信息学的分析啦。首先进行数据处理,对策叙述里质量进行统计,例如有效细胞数,各个细胞中个基因的饱和度等。之后就是一些数据的可视化过程,也是单细胞测序最终的结果。

 

1、细胞不同类群的tSNE图

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利用tSNE图将不同类型的细胞分成不同的细胞群体,每一个点代表一个细胞,不同的颜色表示不同的类别。

2、细胞亚群基因表达热图

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对于不同的细胞亚群每个细胞都会由特意表达的基因,基因在不同的细胞中表达量也不尽相同,颜色越黄表示表达量越高,颜色越紫表达量越低。

3、已知标记基因表达分布图

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利用已知在特定类型细胞表达的标记基因,通过分析标记基因在各个细胞亚群中的表达分布可以鉴定细胞亚群属于哪一类细胞,同时也可以验证细胞亚群分类结果是否准确合理。

4、已知标记基因在细胞亚群中的小提琴图

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小提亲图可以将已知的标记基因在不同细胞间的表达情况更明显的展示出来,可以更加直观的看到在哪种细胞中高表达,在那种细胞中低表达。X轴为各个细胞亚群,Y轴为标记基因的表达量丰度。

5、基因表达模式图

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与提琴图类似可以直观地看出基因在不同细胞间表达情况的变化。

6、细胞轨迹分析图

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根据不同组织细胞的基因表达模式,模拟出细胞分化的轨迹,可以看到不同细胞的发育前后关系。在临床中,单细胞测序存在着巨大的潜能,对于肿瘤,生殖,血液,神经,免疫,干细胞领域都有许多突破。临床医生可以根据自己手中的样本资源与需求进行单细胞转录组测序。

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