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文献解读:TMB与肿瘤预后分析

今天跟大家文献解读的是发表在Annals of Translational Medicine (IF: 3.689) 杂志的一篇文章,这是一篇关于透明细胞肾细胞癌的突变负荷与免疫浸润的研究。虽然说TMB与肿瘤的话题已经老生常谈了。但是结合肿瘤免疫浸润以及其他热点的新发表文章还是经常能看见往期也推送过相关文章哦!
 
Exploration of the relationships between tumor mutation burden with immune infiltrates in clear cell renal cell carcinoma
透明细胞肾细胞癌中肿瘤突变负荷与免疫浸润的关系的探索
 
该工作主要研究透明细胞肾细胞癌(ccRCC)中肿瘤突变负荷(tumor mutation burdenTMB)与预后以及与免疫浸润的潜在关联。作者从TCGA数据库下载了336ccRCC患者的体细胞突变数据,并使用“maftools”软件包分析了突变谱。进一步将样本分为高TMB组和低TMB组。对两组样本进行差异表达分析,鉴定了9个与TMB相关的生物标志物。发现单核苷酸多态性(SNP)的发生率高于插入或缺失,且C>T的突变是ccRCC中单核苷酸变异中最常见的。且发现较高的TMB水平会导致较差的生存结果。此外,发现9个与生存相关的基因。高TMB组的CD8 + T细胞,CD4 +记忆静止T细胞,M1M2巨噬细胞以及树突状静止细胞的浸润水平低于低TMB组,尤其是CD8 + T细胞和巨噬细胞与ccRCC的预后呈负相关。最后,作者利用多因素cox回归计算肿瘤突变负荷预后指数(Tumor Mutation Burden Prognostic IndexTMBPI),ROC曲线的AUC0.666。总而言之,较高的TMB与不良的预后是相关的,并可能抑制ccRCC的免疫浸润水平。
 
材料方法
首先从GDC下载ccRCC病人的突变数据,利用R语言maftools进行突变数据分析。并下载了病人的临床信息。接着计算了每个病人的突变负荷,并将病人分为高突变负荷和低突变负荷组,并对不同组绘制KM曲线,进一步利用wilcoxon秩和检验计算两组之间突变负荷的差异性。
接着,计算了两组之间的差异表达基因,筛选log2|FC|>2fdr<0.05认为是差异表达基因。并对差异基因利用clusterProfiler工具进行功能富集分析。然后挑选差异表达基因中19个免疫基因进行生存分析,挖掘预后相关基因。基于TIMER数据库的“SCNA”模块评估了ccRCC中不同突变水平的病人的免疫浸润水平的差异性。利用CIBERSORT对样本进行免疫浸润评估,并利用wilcoxon秩和检验计算高低突变负荷组的免疫浸润水平。进一步进行预后分析采用的是survival包中的coxph函数。并对9个免疫相关基因进行多因素cox回归模型的构建,即TMBPI = Ʃ(βi × Expi) (i=9)。将病人分成高得分和低得分两组并利用logRank检验计算显著性p值。
 
结果
1. ccRCC病人的突变图谱
作者从TCGA下载339ccRCC病人的突变谱,利用maftool包对突变数据进行可视化(图1)。

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 图1. ccRCC病人突变图谱
 
这些突变根据不同的类型进一步分类,其中错义突变占大部分(图2A),且单核苷酸多态性比插入或缺失发生的频率更高(图2B),并且C> T的突变最多(图2C)。此外,我们计算了每个样品中碱基改变的数目,不同的颜色表示不同的突变类型的比例(图2DE)。并展示了ccRCC中排名前10位的突变基因,包括VHLPBRM1等(图2F)。且存在着互斥和共出现的突变(图2G),其中绿色代表共现,红色代表相互排斥。 

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 2.突变信息的统计汇总
 
2. TMB与生存结果,病理分期和肿瘤等级相关
计算336个ccRCC病人每百万碱基突变事件的数量作为TMB,然后将中位数TMB用作临界值,将患者进一步分为高和低TMB水平的两组。较高TMB组的患者的生存结果相比更差(图3A)。且高低组之间其他临床特征存在一定的关联(图3B-F

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 3. TMB与预后及与临床特征的关系
 
3. 低和高TMB组之间的基因表达谱比较
heatmap表明,高TMB组中的基因通常比低TMB组中的基因表达水平低(图4A)。差异分析显示了1,265DEG的(图4B)。并对差异基因进行GO富集分析(图4C)。且选择了与TMB相关的条目进行展示(图4D)。由于TMBccRCC中的免疫信号或途径相关,因此从Immport数据库中提取19个与免疫相关的基因,对它们进行后续分析(表1)。

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 4. 低和高TMB样品中基因表达谱的比较

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表1. 19个免疫相关基因

 

 
4. 突变与免疫浸润的关联
对基因进行生存分析,以筛选与生存高度相关的6个预后免疫基因。IL20BCRPDNASE1的较高表达水平与不良的生存结果呈正相关,而KITMALPLCG2的表达水平与预后呈负相关(图5)。进一步利用TIMER数据库评估了这些基因突变与ccRCC微环境中免疫浸润的潜在关系(图6)。

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 5. 6个TMB相关基因进行生存分析。

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 6. 6种中心TMB相关基因的突变与免疫细胞浸润的关联
 
5. 低和高TMB组中免疫细胞的丰度的差异
使用“CIBERSORT”过滤P>0.05的样品,选择238个样品进行免疫细胞分析,包括121个低TMB样品和117个高TMB样品(图7A)。此外,Wilcoxon秩和检验显示高TMB组的CD8+ T细胞等的浸润水平低于低TMB组(图7B)。 

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7. TMB组和高TMB组之间22个重要免疫比例的比较
 
6. 低CD8 + T细胞和巨噬细胞浸润伴随不良的预后
ccRCC样本中进一步进行了Cox回归模型,Surv(KIRC) ~ B cell + CD8+ T cell + Macrophage + CD4+ T cell + Dendritic cell + Neutrophil cell,发现CD8+ T cell (HR =0.175, P=0.029) and Macrophage与生存有关。利用Kaplan-Meier分析,其中CD8 + T细胞和巨噬细胞的较低浸润水平确实与ccRCC的不良生存结果相关(图8A)。
 
7. ccRCC的TMBPI的构建和评估
基于以上分析结论,免疫特征的改变会导致较低的免疫浸润和不良预后,基于多因素Cox回归模型,将TMBPI构造如下:PI =0.042086×CRP + 0.347889×DNASE1 + 0.118190×IL20RB − 0.027266×KIT − 0.007359×MAL − 0.256051×PLCG2)。然后,我们计算了每位ccRCC患者的TMBPI,并将其分为高(n = 265)和低风险水平(n = 265),绘制3OS预测的ROC曲线(AUC = 0.666,图8B)。同时,KM曲线显示,高TMBPI的患者显示出较差的生存结(图8C)。

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 8. 两个TMB组中差异免疫细胞的生存分析
 
今天的分享到这里主要内容就介绍完了,文章思路清晰,结合浸润和TMB对肾透明细胞癌预后做了详细的分析,算是TMB预后加强版了,还是很值得借鉴的。疫情慢慢好转,大家也不要放松警惕,好好保重身体健康的搞科研哦!

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