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增强子功能研究新利器 增强子靶向表观基因组编辑技术

哺乳动物的基因表达调控依赖于顺式作用元件(启动子、增强子和沉默子等)和相关的反式作用因子(主要是指转录因子)之间的协作,我们目前对于反式作用因子了解颇多,然而由于现有技术的局限,对顺式作用元件的结构,功能及调控还知之甚少。

近日,美国德克萨斯大学西南医学中心徐剑(Jian Xu)课题组的李开龙刘宇璇等研究者开发出一种全新的表观基因组编辑技术(enCRISPRa 和enCRISPRi)用于增强子的体内外功能研究。相关研究结果在线发表于Nature Communications 上,题为Interrogation of enhancer function by enhancer-targeting CRISPR epigenetic editing

增强子功能研究新利器 增强子靶向表观基因组编辑技术

增强子是一段可与转录因子结合并增强靶基因转录的DNA序列,在细胞分化、机体发育及肿瘤发生发展中均扮演着重要的角色。活化状态的增强子通常富集组蛋白修饰H3K4me1/2和H3K27ac。通过对人类表观基因组的系统研究已鉴定了大量潜在的增强子,但目前为止,我们对这些增强子的体内外功能并不十分清楚。这主要是因为现有的一些技术并不能对这些增强子的功能进行系统的原位及体内外分析。此研究开发出的增强子靶向表观基因组激活或抑制技术(enCRISPRa /enCRISPRi, enhancer-targeting CRISPR epigenetic activation/inhibition)使其成为可能。

enCRISPRa 和enCRISPRi在CRISPR/Cas9 基因编辑技术的基础上做出了改进, enCRISPRa核心元件包含dCas9-p300 (或dCas9-VP64) 融合蛋白、含有两个MS2发夹修饰的sgRNA-MS2和MCP-VP64 (或MCP-p300) 融合蛋白。p300作为经典的组蛋白酰基转移酶,可催化组蛋白H3第27位赖氨酸的乙酰化(H3K27ac);VP64作为激活域,可募集转录复合体到启动子区域。p300 和 VP64之间借由发夹sgRNA和发夹结合蛋白相互作用,协同激活靶增强子的活性。enCRISPRi 核心元件包含dCas9-LSD1 (或dCas9-KRAB) 融合蛋白、sgRNA-MS2和MCP-KRAB (或MCP-LSD1) 融合蛋白,LSD1作为组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶,可去除H3K4的单、双甲基(H3K4me1/2); KRAB 作为转录阻遏物结构域,可诱导结合区域异染色质化。LSD1和KRAB之间借由sgRNA-MS2及MS2结合蛋白相互作用,协同抑制靶增强子的活性。以肌肉分化增强子(MYOD)及珠蛋白增强子(β-globin LCR)作为例子,研究显示enCRISPRa和enCRISRPi可重塑靶区域的表观遗传修饰,进而激活或抑制增强子及其靶基因的转录活性。与其他方法相比,此技术不仅表现出了更稳定的增强子激活或抑制效应,同时还显示了其靶向的高特异性。

增强子功能研究新利器 增强子靶向表观基因组编辑技术

     

进而,研究人员以TAL1致癌超级增强子为例,证明了enCRISPRa可在小鼠体内激活靶增强子及其靶基因TAL1,小鼠因而表现出了更严重的白血病表型。对增强子体内功能的系统性研究是领域内的一个很大的挑战,为此,研究人员构建了enCRISPRi小鼠体内敲入模型,设计针对造血作用中细胞谱系特异性增强子的筛选库进行体内筛选,结果显示该模型不仅验证了一些增强子在造血作用中的功能,而且筛选鉴定得到一些新的候选增强子。

总之,enCRIPRa 和 enCRISPRi 让增强子体内外及原位功能系统分析成为可能,鉴于增强子在生理和病理条件下均扮演着重要角色,该技术有望帮忙研究人员全面系统地分析和鉴定增强子的功能,并阐明其背后的调节机制,加深我们对人类基因组和多种疾病遗传变异的认识。

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-020-14362-5

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