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文献解读:m6A文章的实验思路(套路)

N6-甲基腺苷(m6A)修饰是在mRNA的氮-6位置腺苷碱基的甲基化,它是哺乳动物细胞中最普遍的基因内部修饰。不同于其他的基因修饰,m6A的修饰是动态可逆的,并且在调节前体mRNA成熟、翻译和降解中发挥关键作用的。同时m6A甲基化修饰参与了许多生物学过程和疾病的发生。所以不论是临床还是基础研究中,都有着极大的研究价值。今天小编就带大家梳理一篇在乳腺癌中通过m6A来调节下游基因作用的工作。

这篇文章是2019年3月在Molecular Cancer在线发表,临床表型研究——m6A去甲基化酶FTO在人乳腺癌中上调。

文献解读:m6A文章的实验思路(套路)

为了研究m6A修饰在乳腺癌中的作用,1)作者系统地分析了111个乳腺肿瘤和12个非肿瘤性乳腺组织的转录组特征,与正常组织相比,乳腺肿瘤中核心m6A去甲基化酶FTO显著上调,同时乳腺癌三个临床阶段的DNBC组(ER/PR/Her2+)和晚期组(二级和三级)中FTO的上调。2)乳腺癌细胞系和组织标本中用免疫组化和RNA-dotblotting进行了m6A水平的验证。3)在之后,通过临床结果分析,发现FTO的上调与晚期乳腺癌患者的低生存率显著相关。这些均提示:FTO的上调可能与乳腺癌的发生和发展有关

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(1)细胞表型研究——FTO显著促进乳腺癌细胞增殖、集落形成和减少细胞凋亡。

在人MDA-MB-231MCF-7细胞系中建立了两种稳定的FTO敲除模型,并RNA表达水平和蛋白质表达水平上证实了FTO敲除效应。FTO的敲除显著抑制细胞的生长通过EDU染色法进一步证实了FTO敲除对细胞增殖的抑制作用。mammosphere formation assay 表明FTO的敲除显著抑制两种细胞的乳头球形成。同时敲除FTO抑制乳腺癌细胞集落形成能力。之后,通过流式细胞术检测FTO耗竭导细胞显著凋亡结论:结果表明FTO在控制乳腺癌细胞生长、集落形成和细胞死亡中起着重要作用。

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(2)动物实验——沉默FTO抑制体内乳腺肿瘤生长。

使用FTO shRNA构建稳定的FTO敲除T1细胞(小鼠来源的乳腺癌细胞系)在BALB小鼠中进行了皮下植入实验,FTO的丢失有效地抑制了小鼠乳腺肿瘤的生长。同时Rhein(FTO抑制剂处理的小鼠中观察到乳腺肿瘤阻滞NOD/SCID小鼠中进行了原位异种移植实验稳定表达荧光素酶用于体内成像,与对照相比携带FTO敲除细胞的小鼠几乎没有检测到肿瘤静脉注射FTO敲除T1细胞和对照细胞对小鼠肿瘤转移的影响沉默FTO减轻了小鼠的肺转移结论:结果表明FTO在体内促进乳腺肿瘤生长和转移中起着至关重要的作用。

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(3)分子机制研究之一:+RNA-Seq分析确定BNIP3FTO介导的m6A修饰的下游靶标。

作者FTO敲除细胞FTO抑制剂DMOG处理的细胞进行了转录组测序,GEO2R分析这两个样本中55个具有显著变化的基因重叠,KEGG分析显示,抑制FTO可显著影响富含细胞增殖、细胞周期和凋亡信号通路的差异表达基因。m6A-Seq来绘制m6A-MB-231细胞中m6A的修饰,发现大多数m6A信号在mRNAs的终止密码子附近富集。BNIP3FTO敲除细胞和FTO抑制的细胞中显著上调。string共表达分析表明,BNIP3与凋亡基因如Bcl-2Caspase3密切相关。

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分子机制研究之二:FTO-m6A依赖机制对BNIP3的表观遗传学沉默。

首先检测了乳腺癌细胞中BNIP3的基因表达水平和蛋白表达水平,BNIP3在稳定的FTO敲除细胞中显著上调,沉默FTO可以降低细胞中Bcl2的表达。m6A-核糖核酸免疫沉淀分析,FTO的敲除显著提高了BNIP3基因的m6A水平。m6A核糖核酸序列中,在靠近BNIP3终止密码子的3′UTR中鉴定出3个潜在的m6A位点,荧光素酶报告基因表明BNIP3表达的调节受位点#1上相关m6A修饰的控制.结论:结果表明FTO通过下调脑钠肽3抑制细胞凋亡,位点1调节FTO对m6A修饰的控制。

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分子机制研究之三:BNIP3是一种肿瘤抑制因子,与临床乳腺癌患者的FTO表达呈负相关。

BNIP3在包括乳腺癌在内的各种人类癌症中经常下调,并且MCF-7细胞中抑制了Bcl-2的表达。随后作者对r2数据集的分析显示,BNIP3水平与使用紫杉烷-蒽环类药物和他莫昔芬治疗的乳腺癌患者的总生存率呈正相关。通过对数据集(GSE9014)的分析在乳腺肿瘤中观察到BNIP3FTO水平之间存在显著负相关,同时进行了免疫组织化学检测证实结论。临床队列中观察到BNIP3FTO水平之间存在显著的负相关4T1皮下乳腺癌模型中,FTO抑制或FTO沉默肿瘤样品BNIP3上调。结论:BNIP3与临床样本中的FTO表达呈负相关。

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分子机制研究之四:反向实验验证沉默BNIP3显著减轻了体外和体内依赖于FTO的肿瘤生长和转移抑制。

在FTO稳定敲除乳腺癌细胞中产生了两种不同的靶向BNIP3的shRNAs。结果发现抑制BNIP3减轻了由FTO介导的对细胞增殖的抑制作用。通过EDU染色法证实了BNIP3的相似作用。进行动物实验,植入稳定的FTO敲除4 T1细胞和双敲除细胞(shFTO和shBNIP3),双重敲除促进了小鼠乳腺肿瘤的生长。通过尾静脉注射检测到双敲除T1细胞的肺转移增加。结论:沉默BNIP3可显著减轻体外和体内对肿瘤生长和转移的FTO依赖性抑制作用。

文献解读:m6A文章的实验思路(套路)

 

怎么样,看了这篇文章,是不是觉得m6A甲基化的相关研究是不是也很清晰明了了呢。m6A甲基化最近还是很火热的,找不到课题方向的可以往这块发展,祝大家实验顺利哈。

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