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张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细方法

张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细方法
今日,麻省理工学院(MIT)的张锋教授团队利用基于CRISPR的技术,开发了一种检测新冠病毒RNA的方法。它仅需纯化的核酸分子样本,通过简单的三步,就能在1个小时的时间里完成检测。由于这项技术尚未在真实患者样本中做过验证,因此该方法目前不能用于临床上对新冠病毒感染的诊断
张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细方法
该方法是基于张峰团队2017年发表于Science上的SHERLOCK技术核心是Cas13a切割酶和针对靶序列设计的两条gRNA,一条针对S基因,一条针对Orf1ab基因。理论上,只要样本里有SARS-Cov-2病毒相应的RNAgRNA就会引导Cas13a去切割靶RNA,所以阳性组会出现两条片段,而阴性组则仅有一条对照条带
张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细方法
通过CRISPR方法检测COVID-19相关冠状病毒的步骤
重要提示:请勿将本方法用于临床检测。由于无法获得病人相关样本,所以本方法尚未在临床病人样本中进行过相应验证。我们欢迎有COVID-19病人样本的科研人员与我们联系,我们将友情赠送相关试剂。我们希望这个方法可以为研发COVID-19检测系统的相关人员提供一定的启发,也欢迎对此方法感兴趣的科研人员联系我们提供技术支持。
A.概述
面对新冠病毒相关疾病COVID-19的爆发,目前主要的检测手段为qPCR,但是qPCR所需的试剂和设备并不是特别容易获得,这进一步限制了该疾病的确诊。为了帮助推进疾病你的诊断,在这里我们分享了一个使用基于CRISPRSHERLOCK技术(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)来检测COVID-19的方法。对合成的COVID-19相关冠状病毒RNA片段的检测发现,我们的系统可以稳定检测20-200aM10-100拷贝/微升)的靶序列。从病人样本中抽提出相应RNA之后就可以进行该项检测,并且在一个检测试纸上就可以进行,并不需要特别的设备,时间大约为1 h
SHERLOCK COVID-19检测方法主要有三步,可以在1 h内完成

1. 孵育25 min,使用商业化的RPA kit孵育抽提的核酸样本,在恒温条件下进行扩增;

2. 孵育30 min,通过Cas13检测预扩增的病毒RNA序列;

3. 孵育2 min,通过一个商业化的检测棒将检测结果可视化。
B. 所需特定材料
为了检测COVID-19疾病样本中的相应的RNA,共选择了SARS-Cov-2病毒基因组中的两个基因:S基因和Orf1ab基因。并且设计了特定的RPA扩增引物和LwaCas13a CRISPR gRNAs。通过连续稀释合成的COVID-19疾病样本的S基因和Orf1ab基因RNA片段,最终确定该方法可以检测10-100拷贝/微升。下图是一个可视化的检测结果:
张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细方法
C. 材料和试剂:
该方法所需RNA样本与进行qRT-PCR所需RNA样本一致。
试剂:

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D. 实验流程
重要提示:为了防止交叉污染,步骤1和步骤2应该分别在独立的试验区域开展。步骤1需要在专门的扩增区域开展,并且此步对污染非常敏感。扩增的样本不要在步骤1的区域里打开。步骤2需要在独立于步骤1的区域开展。另外,所有的准备步骤均需冰浴开展。
步骤1-在预扩增区域进行恒温扩增
为了检测相关样本,需要设置两个独立的反应,一个检测S基因,一个检测Orf1ab基因。另外,可以使用合成的病毒片段作为S基因和Orf1ab基因的阳性对照。不加任何病人样本的作为阴性对照。
加入29.5 μl RPA试剂盒中的复水缓冲液重悬冻干RPA沉淀。
S基因检测反应体系:

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Orf1ab基因检测反应体系:
张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细方法
充分混匀之后42 ℃恒温水浴25 min,反应结束后立即放置到冰上准备进行步骤2.
步骤2-通过Cas13检测病毒RNA序列
取出一管LwaCas13a蛋白储存液(2 mg/mL, 4 μl),加入122.5 μL储存液重悬混匀。
S基因检测反应体系:

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Orf1ab基因检测反应体系:
张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细方法
准备好之后涡旋混匀,离心,之后在37 ℃水浴30 min。反应结束后置于冰上等待进行步骤3.
步骤3-可视化检测结果
80 μl HybriDetect Assay Buffer加入步骤2反应结束的管子中,并充分混匀。之后将其室温放在试管架上。取一根HybriDetect Dipstick放到每个管子里,等待结果即可。
结果判断:
张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细方法
阳性组有两个条带,阴性组只会出现一个条带。如果SOrf1ab基因检测结果均出现2个条带,则可认为COVID-19检测阳性。
参考资料:
10.1126/science.aam9321
https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd1703a3da4d3/t/5e46d16cf617da2f796f926e/1581699437272/COVID-19+detection+%28v20200214%29.pdf

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