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  2. 研究进展

王进组开发分析RNA端帽表观转录组新方法并发现了新端帽

5’端帽(cap)是位于几乎所有类型细胞或病毒RNA 5’末端的一种特殊化学修饰【1, 2】。以不同形式存在的7-甲基鸟苷端帽(m7GpppX)【2】是真核细胞和病毒信使RNA的一个独特标志。m7GpppX端帽有一些重要的生物功能,例如稳定信使RNA并确保它们被有效地用于翻译,调控基因表达等 【2】。在真核细胞中,信使RNA的加帽和去帽修饰过程均被高度调控【3-5】。此外,第二个核苷酸的核糖2’-O甲基化(Nm)能被哺乳动物细胞先天免疫系统识别,是哺乳动物细胞用于区分自我和非自我RNA的分子标志【6】
 
近年的研究发现了各种GpppX变体,例如存在于昆虫卵母细胞信使RNA中的功能尚不清楚的非甲基化鸟苷端帽(GpppN)【7】,存在于动物和病毒信使RNA中的m7Gpppm6Am端帽【8】以及存在于病毒RNA【9】和一部分RNA聚合酶II转录本【10】包括核小RNA、核仁小RNA和端粒酶RNA中的二甲基或三甲基鸟苷端帽(m2,2,7GpppN)【9, 10】。近年的研究还发现了存在于细菌和真核生物中的核苷酸代谢物端帽【11, 12】,例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)端帽。研究表明NAD端帽具有重要的生物学意义,例如该端帽影响RNA稳定性和翻转,而且在原核细胞和真核细胞中均可被去帽酶去除【1】。此外,NAD端帽的形成过程是启动子特异的而且会激发启动子解脱【12】,表明该端帽可能参与基因转录的调控。尽管端帽具有这些重要的生物学功能,但灵敏、特异而准确地分析端帽的方法的缺失阻碍了系统地研究细胞中的端帽蓝图及其动力学,以及端帽的生物功能、代谢和生理调控机制。
 
分析RNA端帽的传统方法依赖放射性同位素标记(3H,32P,14C)和分离端帽所用的薄层色谱、纸色谱等色谱法【13, 14】。尽管灵敏,该途径缺乏特异性 (13)而且可能产生由细胞毒性导致的人为现象【15, 16】虽然二维电泳【17】能够分析多个端帽结构,但它(1)缺乏鉴定完整端帽结构的特异性,(2)仅限于分析NpppN端帽,(3)不能绝对定量, 只能半定量。近年来,运用以光谱或质谱(LC-MS)为检测手段的HPLC分析端帽的方法被研究开发【18-21】尽管LC-MS提供了化学特异性,但现有的HPLC和LC-MS方法普遍不灵敏而且不能定量分析端帽结构。
 
近日,内蒙古大学王进研究组与麻省理工学院Peter Dedon研究组联合在Nucleic Acids Research上发表了题为Quantifying the RNA cap epitranscriptome reveals novel caps in cellular and viral RNA的论文。该研究开发了能灵敏而准确地定量分析5’端帽表观转录组的新方法− CapQuant。该方法结合离线HPLC富集、同位素稀释和LC-MS/MS,能够准确、特异而灵敏地量化所有类型的RNA端帽结构。
 
王进组开发分析RNA端帽表观转录组新方法并发现了新端帽
CapQuant方法实现了在阿摩尔水平以上广阔的动态响应范围内端帽分析的高覆盖和绝对定量。该方法的大致流程是:1)总RNA分离mRNA;2)加入稳定同位素标记的端帽标准品(大多为自主合成,非市售商品);3)NP1酶解;4)离线HPLC分离富集;5)SpeedVac浓缩;6)LC-QQQ质谱分析。同位素稀释方法是质谱准确定量的黄金标准,该方法还利用挥发性的离子对试剂进行目标物的分离富集(离线HPLC),显著提高了检测灵敏度。
 
CapQuant可用于分析21个典型端帽:m7GpppN、m7GpppNm、GpppN、GpppNm、m2,2,7GpppG (N = C, U, G, A, m6A)和5个代谢物端帽:NAD、FAD、UDP-Glc、UDP-GlcNAc、dpCoA。CapQuant克服了现有端帽分析方法的特异性差,检测到的端帽数量少等缺陷,可以准确、特异而灵敏地量化任何生物体内的RNA端帽表观转录组。应用该方法,课题组定量分析了人类细胞、细菌、酵母、老鼠组织及病毒等样本的26种不同端帽结构,成功检测到了其中14种不同端帽结构(m7GpppN、m7GpppNm、NAD、FAD、UDP-Glc、UDP-GlcNAc),并且在人类细胞和老鼠组织中首次发现了4种新端帽结构(m7Gpppm6A,FAD,UDP-Glc,UDP-GlcNAc)
 
该研究还发现了端帽具有组织特异性,尤其是m7Gpppm6A端帽(老鼠肝脏中检出,而肾脏中未检出)。最近的体外生化研究表明合成信使RNA端帽m6Am的PCIF1酶也能够作用于信使RNA的m7GpppA端帽而生成m7Gpppm6A端帽【22, 23】。因此,在细胞内m7GpppA端帽可能会被2’-O甲基化或N6-甲基化,或两者兼有。
 
该研究在所有样本的RNA中都检测到4个核苷酸代谢物端帽(NAD、FAD、UDP-Glc、UDP-GlcNAc),此实验结果揭示核苷酸代谢物可能都可以作为细胞和病毒RNA的端帽,而且它们的水平和细胞内相应代谢物水平呈现出一致性【24-26】。这表明代谢物端帽水平可能随细胞状态而变化。其次,酿酒酵母信使RNA的端帽表观转录组在氧化(过氧化氢)和烷基化(甲基甲磺酸)应激作用下的变化很小,只有几个端帽的水平有较大变化,包括UDP-GlcNAc水平在统计上显著升高。再次,该研究还发现登革热病毒NS5聚合酶和宿主RNA聚合酶一样,能够用核苷酸代谢物端帽进行起始转录。此外,CapQuant分析结果还揭示14%的登革热病毒RNA基因组含有m7GpppA端帽,12%的人类细胞信使RNA和3%的老鼠肝脏信使RNA均含有m7Gpppm6A端帽。这些实验结果说明可能在特定细胞环境中2’-O甲基化不是抑制先天宿主抗病毒应答所必需的。此外,该研究还揭示了CapQuant还能够用来分析转录起始位点(TSS)
 
综上所述,CapQuant是一项具有广泛应用前景的能够精准量化细胞或组织中RNA端帽蓝图的新方法。例如,(1)CapQuant可用来研究全转录组(编码RNA和各种非编码RNA)的端帽表观转录组的动力学及其调控机制,特定端帽的功能、动力学及其调控机制,以及在多种生命过程中或不同生命状态下RNA加帽和去帽的机理及其调控机制等;(2)结合转录本特异纯化方法【27】,CapQuant能够实现特定转录本端帽表观转录组的准确量化;(3)CapQuant可用于研究端帽结合蛋白【28】如eIF4E和CBC在基因表达调控方面的作用。
此项研究还联合了新加坡南洋理工大学,新加坡癌症科学研究所(CSI),新加坡国立大学,得克萨斯大学医学分校,圣路易斯大学,康奈尔大学和麻省理工学院的几个研究组的科研人员。
 
专家点评
王进组开发分析RNA端帽表观转录组新方法并发现了新端帽
袁必锋(武汉大学化学与分子科学学院教授,国家 ”优青”)
 
该研究开发了能灵敏而准确定量分析RNA的5’端帽表观转录组的新方法—CapQuant。该方法结合离线HPLC富集、同位素稀释和LC-MS/MS分析了21个典型端帽:m7GpppN、m7GpppNm、GpppN、GpppNm、m2,2,7GpppG (N = C, U, G, A, m6A)和5个代谢物端帽:NAD、FAD、UDP-Glc、UDP-GlcNAc、dpCoA。该方法克服了现有的分析端帽方法的难于定量、化学特异性差、局限于单个端帽分析等缺点,实现了高灵敏度、高准确性检测端帽结构。定量分析了人类细胞、老鼠组织、酵母、细菌和病毒等样本的26种帽结构,其中首次发现人类细胞和老鼠组织中4种新帽结构(FAD, UDP-Glc, UDP-GlcNAc和 m7Gpppm6A),为转录组RNA帽结构研究提供了重要的新视角。研究发现帽结构具有细胞和组织特异性,这引起对帽结构变化过程及调控机制的进一步探究,引发对端帽结构生理功能的思索。该方法实现了转录组端帽结构的准确定量分析;可以用于研究不同类型非编码RNA或特定的端帽结构加帽和脱帽动态变化过程,探究其调控机制;用于研究端帽结合蛋白在表观遗传调控中的作用,为转录组端帽结构研究提供了新的分析检测方法。
 
原文链接:
https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e130/5558129?searchresult=1
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