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研究蛋白互作三个经典实验:酵母双杂交、CoIP和GST-pulldown

在分子机制的研究中,蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了,研究蛋白作用的方法有很多,今天我们介绍三个:酵母双杂交,CoIPGST-pulldown

酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid System,Y2H)

研究蛋白互作三个经典实验:酵母双杂交、CoIP和GST-pulldown

酵母双杂交技术是验证蛋白间相互作用的经典方法之一。原理是在真核细胞调控转录过程中的转录激活因子GAL4的两个结构域:DNA结合域BD转录激活域AD在分离的时候不具有转录激活功能,而当两者结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。因此,我们将所要研究的目的基因(蛋白A和蛋白B)分别装载到这两个质粒载体中,两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。当转入相应酵母菌株后,若在酵母内表达的不同蛋白发生互作,则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合,再进一步与上游激活序列结合,激活相应报告基因的表达。

 

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)

研究蛋白互作三个经典实验:酵母双杂交、CoIP和GST-pulldown

免疫共沉淀是另一种研究蛋白相互作用的经典方法。原理是如果蛋白A与蛋白B(直接或间接)结合,那么当我们用抗体去结合蛋白A的时候,蛋白B也能被拉下来;当然,反之亦然。因此,首先提取蛋白,然后在提取的蛋白中加入蛋白X的抗体,孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上),然后变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳,经过Western Blot检测蛋白B,当然,也可以直接将沉淀下来的蛋白通过质谱分析其它蛋白。

 

GST-pulldown

 

研究蛋白互作三个经典实验:酵母双杂交、CoIP和GST-pulldown

GST pulldown 是另一项验证蛋白相互作用的经典实验,其基本原理是将靶蛋白-GST(Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶)融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过WB或者质谱进行检测和鉴定。

 

以上三种方法是研究蛋白互做最常用的三种方法,一般Y2H常用来筛选,Co-IP和GST pulldown用来验证。研究不仅在整体蛋白层面,还包括蛋白的结构域层面,GST pulldown是用来验证蛋白A与B的直接结合的,而Y2H和Co-IP结果则还有间接作用以及非特异性作用。

 

最后附上五篇使用以上三种方法研究蛋白质互作,发表在JBC杂志上的经典文章:

  1. Wei J D, Kim J Y, Kim A K, et al. RanBPM protein acts as a negative regulator of BLT2 receptor to attenuate BLT2-mediated cell motility[J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(37): 26753-26763.
  2. Wu F, Peacock S O, Rao S, et al. Novel interaction between the co-chaperone Cdc37 and Rho GTPase exchange factor Vav3 promotes androgen receptor activity and prostate cancer growth[J]. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(8): 5463-5474.
  3. De Gois S, Slama P, Pietrancosta N, et al. Ctr9, a Protein in the Transcription Complex Paf1, Regulates Dopamine Transporter Activity at the Plasma Membrane[J]. Journal of Biological Chemistry, 2015, 290(29): 17848-17862.
  4. Yang J, Wang Q, Zheng W, et al. Receptor for activated C kinase 1 (RACK1) inhibits function of transient receptor potential (TRP)-type channel Pkd2L1 through physical interaction[J]. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(9): 6551-6561.
  5. Guerrera D, Shah J, Vasileva E, et al. PLEKHA7 recruits PDZD11 to adherens junctions to stabilize nectins[J]. Journal of Biological Chemistry, 2016, 291(21): 11016-11029.

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