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苏洁博士等发现介导上皮细胞间质化的重要因子

上皮-间充质转化(Epithelial-to-mesenchymal transitions,EMTs)是一种表性塑造过程,在发育、伤口愈合、纤维化和癌变过程中赋予上皮细胞迁移和侵袭的特性。EMT主要由转录因子SNAIL、ZEB、TWIST以及平衡该调控网络的microRNA共同驱动产生【1】。转化生长因子(TGF-β)是发育性和成纤维性EMTs的重要诱导因子,TGF-β信号和EMT异常与肾纤维化、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、肺纤维化、癌症的发病相关【2】。TGF-β依赖于RAS和MAPK途径诱导EMTs【3】。但这些信号如何整合并诱导EMTs发生,以及其与更广泛的病理生理过程的关系,有待进一步的研究。

2020年1月8日,美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心的Joan Massagué团队(第一作者为苏洁博士)Nature杂志上发表文章 TGF-β orchestrates fibrogenic and developmental EMTs via the RAS effector RREB1发现MAPK通路下游因子,RREB1是和TGF-β一起介导EMT 的关键因子。 RREB1通过招募由TGF-β激活的SMAD转录因子到SNAIL等基因的调控位点,从而介导TGF-β诱导的上皮细胞间质化程式。TGF-β诱导的上皮细胞间质化在多种细胞微环境中具有不同的作用,RREB1在肿瘤发生,肿瘤纤维化和胚胎发育等多个细胞微环境中都起着关键的作用。

苏洁博士等发现介导上皮细胞间质化的重要因子

研究人员首先从Pdx1-cre;Cdkn2afl/fl;lox-stop-lox (LSL)-YFP (CIY) 小鼠培养胰腺上皮类器官,TGF-β处理导致Snail表达上调4倍,不改变类器官的形态和生存;在类器官中突变KRAS(G12D),TGF-β处理导致Snail表达上调30倍,随后降低E-cadherin、上调ZEB1、类器官解体并凋亡,符合致死性EMT的所有特征。但TGF-β负反馈调控的Smad7表达并不依赖于KRAS(G12D)。TGF-β上调4倍及以上的基因共56个,其中13个基因的表达被KRAS(G12D)突变进一步上调,包括Snail1Has2等EMT调控子,而且TGF-β的这些调控依赖于SMAD4。TGF-β与受体激酶TGFBR1、TGFBR2结合,激活SMAD2-SMAD3-SMAD4三聚体复合物,SMAD2/3/4与转录因子相互作用并靶向特定的启动子和增强子。ChIP-seq试验显示,KRAS(G12D)并不影响SMAD2/3在染色体上分布,而KRAS(G12D)依赖的TGF-β靶基因上RREB1结合模体特异性地在SMAD2/3结合位点上富集;shRNA筛选试验显示Rreb1、Sox4对TGF-β诱导KRAS(G12D)-EMT凋亡是必需的。RREB1包含15个锌指结构,但功能和调控都未知。在胰腺癌细胞中,TGF-β刺激诱导RREB1和SMAD2/3相互作用。RREB1和SMAD2/3在基因组上分布具有很大部分的重叠,包括Snail1、Has2。TGF-β是否存在对RREB1分布没有影响;但ERKi、MEKi削弱RREB1与Snail1、Has2等基因调控区域的结合。总之,EMT中,RREB1是一个受RAS调控的SMAD共因子。

胰腺癌细胞中,RREB1缺失减少TGF-β诱导的SMAD2/3与Snail1、Has2调控区域的结合,抑制其表达和EMT的发生。在KRAS突变的胰腺祖细胞中,TGF-β能够诱导致死性EMT,抑制PDA的发展。相比于野生型,Rreb1缺失的细胞具有更高的致瘤性、具有分化良好的上皮组织学特征、更少的凋亡细胞、更少的SNAIL+细胞。此外,人类胰腺癌中RREB1被下调,5%的胰腺癌中RREB1被突变。在KRAS突变的肺腺癌细胞系393T3、A549中,TGF-β诱导EMT发生,促进肿瘤生长,而RREB1的缺失抑制SNAIL1等表达,抑制EMT发生,抑制肿瘤形成、生长和转移。即RREB1介导TGF-β诱导的EMT,与EMT相关的致瘤表型无关。

小鼠胰腺癌细胞中,TGF-β上调且KRAS依赖的13个基因大多与纤维结缔组织的沉积有关,RREB1缺失降低TGF-β对相关基因如Il11、Wisp1等的诱导表达,而且RREB1、SMAD2/3在相关基因中均有分布。393T3肺结节中有明显的癌相关肌成纤维细胞和丰富的胶原沉积,而敲除Rreb1的肺结节则没有,即TGF-β激活的SMAD和RAS激活的RREB1结合,驱动胰腺癌细胞和肺腺癌细胞的成纤维性EMT过程。此外,EMT参与乳腺导管形态发生,RREB1对正常乳腺上皮细胞中TGF-β诱导的EMT也是必需的。

原肠胚形成过程中,多能干细胞在迁移和分化过程中经历EMT,RREB1是否具有作用?胚胎分化2天后,中胚层基因Eomes、Fgf8等表达逐渐增加,在第4天达到高峰;同时EMT驱动因子Snail1、Twist1等也在第4天达到高峰。而且EMT、干细胞分化和原肠胚化的基因转录特征同步性富集。一旦敲除Rreb1将抑制Snail1和中胚层关键基因的表达。RNA-seq显示野生型和Rreb1敲除胚胎干细胞(ES)在多能期两者基因表达没有显著差异;但在分化4天时,Rreb1缺失导致分化缺陷,同时缺乏干细胞分化、EMT和原肠胚化基因特征。SMAD2/3和RREB1在全基因组的分布具有重合,而且ATAC-seq显示Snail1、Wisp1等EMT、中胚层分化基因具有可接近性,进一步表明两者直接合作调控中胚层分化和EMT。野生型ES嵌合体通常正常发育,约75%的Rreb1-/-ES细胞嵌合体具有严重的形态学异常。在胚胎8.5天(E8.5),Rreb1-/-ES嵌合体显示出神经外胚层的异常发育,包括不规则的神经板折叠、不均衡的双侧不对称的头褶、层间边界缺陷、胞体样结构异位。E7.5时,约75%的Rreb1-/-ES嵌合体显示出发育迟缓或形态异常。野生型胚胎和嵌合体中,当细胞通过原始条纹进入时,E-cadherin转化为N-cadherin,但在Rreb1-/-ES嵌合体中,异常隆起或皱褶内的细胞继续表达E-cadherin,或没有N-cadherin的上调,或两者同时表达,导致胚胎异常。即Rreb1缺失导致细胞在原始条纹处没有经历适当的EMT,导致原肠胚缺陷。

总的来说,本研究揭示了RAS效应蛋白RREB1作为TGF-β激活的SMADs转录共因子,将RAS和TGF-β通路连接起来协同参与发育性和成纤维性EMT发生。该研究增加了我们对上皮可塑性的调控及其在发育、纤维化和癌症中病理生理作用的理解。

原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1897-5

1. De Craene, B. & Berx, G. Regulatory networks defining EMT during cancer initiation and progression. Nat. Rev. Cancer 13, 97–110 (2013).

2. Meng, X. M., Nikolic-Paterson, D. J. & Lan, H. Y. TGF-β: the master regulator of fibrosis. Nat. Rev. Nephrol. 12, 325–338 (2016).

3. David, C. J. et al. TGF-β tumor suppression through a lethal EMT. Cell 164, 1015–1030 (2016).

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