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细胞凋亡常用检测方法汇总

细胞凋亡,以前也称细胞程序性死亡,是指在一定的生理或者病理条件下,细胞主动的、高度有序的、自己结束其生命的过程。细胞凋亡是生物体中一种普遍存在的现象,胚胎形成、个体发育、衰老和损伤细胞的清除等都与细胞凋亡密切相关。检测细胞凋亡的方法很多,如电子显微镜或者光学显微镜下的形态学观察、细胞DNA提取物的DNA梯状带电泳实验等。而流式细胞术是非常重要的检测细胞凋亡的方法,不仅可以定性,也可以定量。

细胞凋亡可分为早期凋亡(细胞膜结构发生变化,磷酯酰丝氨酸外翻)、早中期凋亡(细胞质密度增加,线粒体膜电位消失,通透性改变,释放细胞色素c、到胞浆)、中晚期凋亡(细胞凋亡的信号转导)、晚期凋亡(DNA降解为180-200bp片断)。

细胞凋亡的流式检测方法汇总:下面我们一一进行介绍。

细胞凋亡常用检测方法汇总

一、用的最多的Annexin V /PI双染色法检测早期凋亡

正常细胞膜的磷脂分布是不对称的,活细胞中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)位千细胞膜的内表面,细胞凋亡时,细胞膜发生变化, PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin V是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白,Annexin V可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS, 而活细胞的PS位千细胞膜的内表面,无法与Annexin V特异性结合。所以可以用FITC偶联的annexin V鉴别凋亡细胞和活细胞。

坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面,Annexin V也能识别坏死细胞表面的PS, 所以Annexin V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。而PI染料能够与细胞内的DNA结合,区分坏死细胞和活细胞。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整, PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合,所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞,而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合,坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光,被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用,就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

细胞凋亡常用检测方法汇总

操作方法(以悬浮细胞为例)

1、细胞在培养板中培养一定时间后,收集细胞于1.5EP管中,4°C,350g离心5min,弃上清,用500ul预冷的PBS洗涤细胞2次;

2、分别加入5μl AnnexinV+5μlPI +95μl AnnexinV Bind Buffer(含钙离子的缓冲液)重悬细胞,室温、避光20min;

3、向每个管中加入200μl的AnnexinV Bind Buffer,尽快上机检测。

4、对照组的设置:

(1)空白对照:诱导凋亡的细胞不加荧光剂,用来调电压;

(2)单染对照:只加PI或AnnexinV(FITC),用来调节补偿;

(3)阳性对照:诱导凋亡的细胞加本次实验的所有荧光试剂,确认试剂、仪器、操作没有问题;

(4)阴性对照:正常细胞加本次实验的所有荧光试剂,确认细胞正常状态,排除假阳性。

5、上机操作时也是先调节电压,再调节补偿。

结果分析

横坐标为AnnexinV强度,纵坐标为PI强度,对AnnexinV来说,十字门左边是阴性细胞群,右边是阳性细胞群;对PI来说十字门上边是阳性细胞群,下边是阴性细胞群。

细胞凋亡常用检测方法汇总

实验要点

(1)贴壁细胞如何处理?

对于贴壁细胞,凋亡染色,用不含EDTA的0.25%胰酶消化成单细胞悬液即可,其他参考悬浮细胞操作方法,控制消化时间,过渡消化会损伤细胞。

细胞凋亡常用检测方法汇总

(2)做流式凋亡是否需要调节补偿?

如果使用的是相邻通道的荧光素,要调节补偿。

细胞凋亡常用检测方法汇总

(3)冻存过的细胞样本,还可以做流式凋亡检测吗?

不建议采用冻存过的细胞样本,尽量使用新鲜的样本。

(4)保证细胞活性,避免用力吹打,预冷PBS清洗,缩短上机时间,可上机前5min再加PI;

(5)血小板含有PS,能与AnnexinV结合,故需除去

(6)结果分析需依据对照比较

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二、细胞凋亡—线粒体膜电位检测

JC-1是亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。正常生理状态下,线粒体负电性高,JC-1进入线粒体以多聚体存在,红色荧光强,细胞凋亡时,线粒体去极化产生,负电性降低,JC-1则以单体存在细胞质,绿色荧光增强。

细胞凋亡常用检测方法汇总

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实验要点

(1)37°C 培养箱中孵育;

(2)JC-1工作液现配现用;

(3)PH的变化影响膜电位,保持平衡染液中PH的一致性;

(4)JC-1会与蛋白结合,降低燃料的浓度,引起假去极化;

(5)用补偿微球或借用FITC-PI的补偿。

三、细胞凋亡—活化的caspase-3检测

活化的caspase-3由其前体裂解的一个17KD亚单位和一个12KD亚单位组成,形成异二聚体,可被Anti-Active Caspase-3抗体特异性识别。用荧光素标记Anti-Active Caspase-3抗体即可检测到活化的Caspase-3。

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实验流程(以悬浮细胞为例

1、细胞在培养板中培养一定时间后,收集细胞于1.5EP管中,4°C,350g离心5min,弃上清,用500ul预冷的PBS洗涤细胞2次;

2、固定细胞,洗涤之后加入破膜剂(破胞膜);

3、加入荧光素标记Anti-Active Caspase-3抗体,进行胞内抗体染色,室温30min;

4、加破膜剂洗涤之后,FACS buffer重悬细胞,流式上机检测。

结果分析

横坐标为活化的Caspase-3强度,活化的Caspase-3阳性的细胞即为发生凋亡的细胞(红色部分)。

细胞凋亡常用检测方法汇总

实验要点

(1)固定破膜之后细胞会损失,前期可以多收集一些细胞。

四、细胞凋亡—DNA片段化的检测

细胞凋亡时染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180~200bp及其整数倍的寡核苷酸片段,。DNA一旦发生片段化,在DNA双链结构上会出现很多缺口,可以使用FITC标记的DUTP或BrdU在酶的作用下掺入到缺口中,然后检测掺入的信号强度,来判断发生片段化的程度。

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实验流程:跟上面提到的步骤差不多,在此不做赘述。

固定-洗涤-FITC-dUTP染色-洗涤-PI/Rnase染色-上机检测

结果分析

横坐标为DNA含量,纵坐标为Brdu强度,Brdu阳性的细胞即为发生凋亡的细胞。

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