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骨组织切片最重要的步骤:脱钙

骨组织切片最重要的步骤就是脱钙。

近期,不少朋友在公众号后台私信咨询骨组织切片的问题,你们的每一条反馈小编都记在小本本上,今后会慢慢推出的。

其实,万变不离其宗,良好的制片是所有病理实验的基础。

对于骨组织来说,脱钙是最关键的步骤,能不能制出好的切片以及后期染色如何,全看这一步了。脱钙值得单独写一期内容。

骨组织切片最重要的步骤:脱钙

本期重点:骨组织脱钙。

01

脱钙的应用场景

在临床上,骨组织切片并不是常见的。但是在医学科研中,常常需要用到脱钙技术。如果有小伙伴是骨科的,那么本文就是为你而写的。

一般来说,只要组织中含有骨、软骨等都需要脱钙后才能制片。

例如,研究吸入性药物时,鼻腔是需要重点关注的组织结构;研究骨折愈合、骨组织肿瘤时,脱钙必不可少;研究血液肿瘤时常需观察动物胸骨骨髓红系、粒系和巨核系,脱钙还是少不了,等等。
总之,脱钙是医学科研中的常客,这也是科研源于临床而不同于临床的地方。而本文所提到的实验条件都是针对实验动物如大小鼠、食蟹猴或者比格犬,并不一定适用于临床人体标本。

02

脱钙前的工作

接触骨组织时,很多人会条件反射地代入既往处理一般性组织时的经验,可事实并非如此。

首先,骨组织固定时间至少要达到24h,一般不超过48h。固定时间过短,后期切片会泛红,看起来很奇怪。固定时间太久,严重影响抗原,后期做免疫组化实验极可能出现假阴性。

由于固定时间很长,而很多实验室并非恒温实验室,北方好多实验室冬天的室温比夏天还高。因此小编建议放入4℃冰箱中,保持在低温中固定,条件温和而稳定,效果会比较好。

固定液要舍得用,一般为骨组织体积的30倍左右。

03

脱钙

说了这么久,正片终于开始了。

常用的脱钙液有有机酸、无机酸、混合酸以及电解脱钙液等。

10%-50%的甲酸水溶液是常用的有机酸。脱钙时间由甲酸的浓度而定,10%甲酸脱钙需要3天,而50%甲酸脱钙需2天。甲酸浓度越高,脱钙速度越快,但同时也会伤害骨组织,导致组织结构不完整,研究鼻腔这种精细结构时50%甲酸是不可取的。脱钙过程需勤换脱钙液,保持浓度,小编还是推荐在4℃冰箱中温和地脱钙。注意,千万不要过度脱钙,否则组织会被酸分解,到时整个组织就烂了。

另外一种有机酸是EDTA,即乙二胺四乙酸(注:因枸橼酸钠已被淘汰使用,不做介绍)。这是一种接近中性液体,可以螯合骨组织中的钙离子。理论上讲它是完美的科研用脱钙液,可以完美地保存骨组织的抗原性、酶类等,但它的脱钙至少需要2周,长的能到3个月,太久了,估计没几个人有耐心等吧。

无机酸一般为硝酸。脱钙强度太大,稍不注意组织就脱烂了,不易控制,小编个人不推荐使用。但是小编还是说一说,万一有高手要试试呢。文献显示,室温下,浓度在8%以上的硝酸脱钙,超过2天,组织会有明显缺损。

混合酸即有机酸和无机酸混合使用,但是脱钙效果不佳,用的较少。

这里补充说一点关于电镜骨组织脱钙的知识。↓

脱钙液配方:EDTA-2Na 5g、双蒸水 50ml、0.2mol/L NaOH 35ml,混匀后蒸馏水定容至500ml。2mm厚的新鲜骨组织放入预冷至4℃的前固定液中固定20min,然后使用PBS缓冲液充分漂洗(其实就是浸泡),再放入上述的脱钙液中,至于4℃固定。骨松质10天即可,但骨密质一般要一个月。后面的步骤常规操作即可。

04

脱钙后漂洗

脱钙结束后要使用流水充分漂洗。这一步也很重要。

流水冲洗过夜,采用冷冷的自来水即可。如果是鼻腔这种精细的组织,则漂洗6h即可,以免组织吸水后膨胀导致原始位置偏移。

这是最好的方法。可以洗去骨组织中残留的酸,从而保证骨组织PH为中性,这时保证后期染色正常的重要步骤。如果没有漂洗干净,后期染色会偏红,蓝色的细胞核也会模糊不清,很蓝瘦的。

05

判断脱钙效果的方法

针灸用的针能轻松戳进骨组织,则代表脱钙完全。这是最经济、最省事的方法。

如果针身弯曲了还是扎不进去,那就更换新鲜的脱钙液,继续脱钙。

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