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利用Image J测量细胞划痕面积方法教程

细胞划痕实验作为检测细胞迁移能力的金标实验,应用非常广泛。其原理是在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为划痕/伤口,边缘的细胞接收到迁移信号会逐渐进入空白区域使划痕/伤口愈合。因其类似体外伤口愈合过程,又名伤口愈合实验(Wound-Healing Assay),广泛用于观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。

通过统计划痕面积(Scratch Area)随着时间的变化率以及伤口愈合百分比(Wound healing percentage)即可说明细胞迁移能力。所以,对于不同时间点下的细胞划痕面积进行量化就是必不可少的一步操作了。
利用Image J对细胞划痕进行量化实质上就是简单的面积测量,但由于细胞迁移之后划痕变得不规则,如何获取这个不规则选区才是难点。
细胞划痕实验中常用的获取选区的方法有查找边缘(find-edges差(variance)滤波法
需要注意的是,由于涉及多个时间点的照片拍摄,拍摄条件可能不一样,请注意添加标尺对实际面积进行校正,然后再进行测量。本教程没有找到合适的图片,就没有校正标尺了。
下面先来看一下最常用的查找边缘(find-edges法,然后在插件中看差(variance)滤波法查找边缘(find-edges)法。
01
查找边缘法
1、打开图片之后,Image-Type-8 bit
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2选做Process-Enhance Contrast勾上Normalize,至于Saturated pixels则需要多尝试几次(感觉参数不合适,Ctrl+Z撤销就行),使得划痕处细胞边缘和背景的分界比较明显即可,这里选择:0.5%;这一步会强化细胞和背景的对比,便于后面更准确地选择划痕;如果细胞和背景本身区分度就比较好的话,也可以不做,最后结果差不多;
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3选做Process-Smooth;这一步其实和上面有一定程度的相悖,这步会使得细胞轮廓又变得模糊,显得更真实,但是第2步增强的颜色对比和边缘对比基本保留了下来;
  • 2步和第3步总的效果跟使用Process-Sharpen,然后Image-Adjust-Brightness/Contrast提高对比度差不多;个人认为第2步和第3步的目的是强化细胞边缘,便于与划痕(背景)区分开来,但往往会造成最后测量的划痕面积稍微偏小;大多数情况下可以不做,直接第4步就行,但是一系列图片中要么都别做,要么都做。不少教程都有这两步,这里稍作说明。

4Process-Find Edges。这一步才是最重要的,也是“查找边缘法(Find Edges)”这个方法的名称来源,会通过二值化处理极大加强细胞和背景的对比,如果细胞的轮廓通过第2和第3步的强化,这步会更明显,如果没有强化也没太大关系;
利用Image J测量细胞划痕面积方法教程 5Image-Adjust-Threshold,通过调节阈值,使得蒙版填满划痕;这一步不能直接用Threshold来构建选区,因为两侧细胞内部可能会存在空洞(下图细胞区域的红色点),这些空洞不属于细胞划痕的面积,要排除在外,但是会被Threshold自动选中。接着点击Apply进行二值化处理,结果使得图片非黑即白;
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6、二值化处理之后,背景颜色均匀,可以直接使用魔棒工具选择划痕,建立选区,选择实际的划痕面积;
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这张图片比较理想,如果两侧细胞长得比较近,有些地方连到一起去了,可能会需要对划痕进行多次测量,然后将面积相加;
7Analyze-Measure
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8、有时候需要把划痕面积轮廓添加到原图上面,作为标记;可以按q键(为什么会是q键?为什么你按q键没反应?见《Image J基础操作:选区和选区管理器》一文),调出选区管理器,将刚刚用魔棒建立的选区存起来,然后再打开一次原图,应用到原图上面;
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这里有种更简便的方法,直接选择File-Revert即可将图片恢复到原来样子,但是选区还保留;
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最后,就是把选区轮廓线盖印到图片上面,方法有多种,具体见《Image J基础操作:选区和选区管理器》一文。
 
02 
插件法
插件下载地址:
http://dev.mri.cnrs.fr/attachments/download/1992/MRI_Wound_Healing_Tool.ijm
1、将下载的文件放到Fiji文件夹中macros/toolsets下;
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2、重启Fiji,然后选择工具栏最右侧的双尖括号,点击MRI_Wound_Healing_Tool
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在新工具栏中出现的两个图标都是这个插件的使用入口,但是只有m是用来测量的,左边的图标是进入这个插件官网的;
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3、插件内置有两种方法,默认是方差滤波法;左键单击m图标,直接秒出结果,不过从本次结果来看,红色选区轮廓线离细胞有点距离,细胞划痕面积会偏小。
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4、那需要修改参数,右键单击m图标,将Variance filter radius值改小一点,将Threshold改大一点,点击OK
利用Image J测量细胞划痕面积方法教程
  • Variance filter radius(方差滤波器半径),要根据图片分辨率来设置,默认是10 px,主要是用来识别划痕边缘,越大计算越慢,而且会导致测量得到划痕面积偏小;

  • Threshold(阈值):将由方差滤波器得到的图像转换为蒙版;如果调小一点选区会更精细,但会丢失掉一部分选区;调大一点,对于划痕区域识别会更准,但对边缘轮廓线会进行近似处理;具体可用之前查找边缘法中的threshold建立选区的操作体验一下。
  • Radius open(空洞半径):可用来关闭组织中的不属于划痕的空洞,要比需要排除的孔大、比划痕小,这个值默认4一般是偏小的,但是也无所谓,因为下面一个参数会很好地过滤掉空洞。
  • Min.size(划痕最小大小):划痕的最小大小,可以进一步排除除划痕之外的其他空洞,这个大小可以使用矩形工具对划痕建立选区后进行测量,大概估算而求得;
 再次点击m图标,这回划痕面积会大一点,而且选区轮廓线也更贴近细胞一点;
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5、以上是默认的方差滤波法,当然这个软件也内嵌了查找边缘法(find-edges,在method里面改成find-edgesVariance filter radiusThreshold两个参数在这种方法之下是失效的,不用管它们;
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6、然后把打开的图片,改成8 bitImage-Type-8 bit,点击m图标即可;

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在这里查找边缘法要准确些,但是其他图片就未必了。而且方差滤波法可以自己调节参数,应对更多复杂的情况,大家有兴趣自己尝试了。
参考资料:

http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool

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