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细胞培养过程中碰到小黑点是什么?(附解决建议)

背景

2018年,我从外省某细胞中心购买一批细胞,细胞刚寄到的时候,培养瓶口处的封口胶完好(没有培养液溢出的痕迹),倒置显微镜下观察细胞形态良好,密度适中,培养液未见混浊或是异物。细胞置于实验室培养箱中过夜,次日传代,传代培养约一周后在镜下观察到细胞密度降低,还发现了一些奇怪的小黑点。

细胞培养过程中碰到小黑点是什么?(附解决建议)

困惑

难道是污染了?这是我脑袋里冒出来的第一个想法。但是培养液没有出现明显的浑浊,到底是不是污染,如果是污染又是什么原因造成的什么类型的污染呢?如何除去这些小黑点呢?这让我感到非常的纠结。

探索

经过观察发现,在低倍镜下这些散在的小黑点仿佛一层模糊的黑点状背景,在高倍镜下仔细观察发现黑点似乎在抖动。这些小黑点到底是常见的微生物污染(细菌、真菌和支原体等),还是细胞碎片或者是某试剂中的杂质呢?

1、微生物污染?

处理:连续观察细胞状态,清洗细胞,并用多种抗生素“诊断性治疗”和染色的方法分析的链霉素;另一瓶细胞采用25ug/ml的制霉菌素处理;Hoechst 33258染色后用荧光显微镜观察,取适量培养基置于无细胞的培养瓶中过夜,在镜下观察有无小黑点。

结果:PBS清洗细胞,可以改善镜下视野的背景,但继续培养小黑点又会再次出现。镜下见细胞间隙较大,部分细胞中可观察到少量颗粒状物质,但是在小黑点增加的过程中细胞状态没有进一步变差。无细胞的培养瓶中没有出现较多散在的小黑点样物质。单纯加用青霉素、链霉素或制霉菌素分别处理细胞后,镜下的黑色小点未见明显减少。Hoechst 33258染色后未在荧光显微镜下观察到细胞膜表面的绿色小点。

结论:细胞状态欠佳。另外,由于常规抗生素处理效果不明显,荧光染色也未发现特异部位的染色,而且培养液外观未见浑浊、细胞状态也没有进一步变差,这提示小黑点不是我们实验室中常见的细菌、真菌或是支原体污染。

2.非生物类的杂质?

经过尝试性的抗生素处理,虽然不能完全肯定小黑点不是微生物污染,但是可以初步得出常规抗生素无效的结论。虽然在镜下看到这些小黑点的确让人很心烦,但是对于我的细胞状态并没有产生进一步持续恶化的负面影响。接下来我考虑从细胞和试剂角度进行分析。

处理:一方面使用新一批的血清,且不经过热灭活处理,重新配制培养基,用于细胞培养,并进行观察;另一方面将新配制的培养基用于同一实验室未出现过小黑点的原代细胞培养,持续观察是否出现小黑点。

结果:使用未经热灭活处理的血清培养的细胞,镜下视野中观察到的小黑点数量比原培养基细胞中的少,但是还是可见少量小黑点存在。使用新培养基的原代细胞中没有出现小黑点样物质。

结论:综合考虑认为,我在此次实验中遇到的小黑点可能是细胞碎片以及血清聚合物等非生物类的杂质。

收获

为什么会出现小黑点?

在排除了常见微生物污染的基础上,此次实验中的非生物性杂质是如何产生的呢?我认为,与未出现小黑点的原代细胞相比,复苏细胞经过邮寄运输后,在新环境和营养条件下进行培养,细胞状态受到了影响,造成了细胞碎片增多,而细胞器或碎片散在分布于培养液中,镜下就呈现为小黑点状物质。小黑点在复苏细胞的传代培养过程中逐步出现,且经过PBS多次清洗后换液出现镜下小黑点减少、但继续培养又会增多的现象也支持这一判断。同时也存在由于热灭活过的血清中沉淀物质增多,以及血清中存在特殊聚合物等因素的影响。

为什么此实验中的黑色小点与大家常常讨论的“黑胶虫”相似而又不同?

实验中我的细胞状态欠佳,但并未在小黑点的出现后越来越差,但朋友们讨论时提到的黑色小点,往往严重影响细胞状态,并形象地称之为“黑胶虫”。虽然有研究发现联合应用环丙沙星和哌拉西林可以消除细胞培养中运动的小黑点。但我认为,不同的实验人员所定义的“黑色小点”是有区别的,受主观因素的影响较大,有人描述的黑胶虫像细菌,有的像支原体,也有本次实验类似的细胞碎片,我们认为一方面可能有人遇到的是不常见的或者是对常用抗生素耐药的微生物污染,另一方面,同时也可能存在着因实验基础不扎实、对常见微生物污染认识不准确而生拉硬套定义出的“黑胶虫”,所以在处理时还不能够一概而论。

为什么会出现细胞状态好时小黑点数量较少,细胞状态不佳时,小黑点增多的现象?

如果是因为不常见或者耐药的微生物污染造成的小黑点,这种“此消彼长”的现象可以认为是微生物污染严重造成细胞状态的不良;但如果是非生物性的杂质或聚合物,我认为此时“此消彼长”现象的因果关系就应该是因为细胞状态不良而造成的细胞碎片(小黑点)增多了。

箴言

此次实验中的小黑点与细胞状态不良时产生的细胞碎片以及非生物类的血清聚合物有关。随着研究的深入,可能会对小黑点或者“黑胶虫”有更加明确的认识。但是在目前,我们不应该在未经检测和分析之前,就把某些不常见的细菌、真菌、支原体或者原虫等微生物污染以及未得到正确认识的常见微生物污染全部都轻率地扫入“黑胶虫”名下。因为这不利于我们培养科学的思维习惯,也是一种不负责的实验态度。

来源: http://www.sci666.com.cn/25826.html

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