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文献解读:单细胞测序结合多种生物信息方法

1. 研究背景

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,多起源于肾小管上皮细胞,近年来其发病率在世界范围内呈上升趋势。根据最近的癌症统计报告,美国每年新增的确诊病例已达65,000例,其导致每年约15,000人死亡。透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是最常见的散发性肾癌(约80%)的病理组织学类型,与其他类型的肿瘤相比,其生存预后较差。近20%的ccRCC病例在诊断开始时进展到晚期,转移性病例的5年总生存率(OS)下降到约10%。随着手术干预、放疗和免疫治疗的发展,肿瘤治疗的组合策略得到了很大的优化。然而,实际的临床效率仍有待提高,30%的ccRCC患者不可避免地出现复发和癌症相关进展。因此,ccRCC转移或进展的分子机制及新的靶点的研究迫在眉睫。这篇文章就是基于单细胞RNA-seq数据开发验证了一个转移相关的预后特征集。

2. 材料和方法

1) 数据:来自GEO的GSE73121数据集的121个细胞样本的原始转录数据;来自TCGA的537个ccRcc的表达谱;以及ICGC的91个患者的表达信息;同时也收集了这些样本的临床信息。

2) 单细胞数据的处理:推断基因组信息,过滤低质量细胞。

3) 在ccRcc样本队列中识别MAGs:首先从RNA-seq数据中检测marker基因。将TCGA-KIRC分为训练集和检验集。使用LASSO推断预后相关的hub基因。构建预后特征MAGs,生存分析,ROC评估。

4) 开发一个检测进展的个性化预测模型:整合MAG和其他临床因素,进行单因素以及多因素分析。

5)TMB的谱系以及相关分析

6) 两个MAG组的功能富集分析:GSEA

3. 结果展示

单细胞RNA-seq谱以及转移相关的marker基因的过滤

作者获取了3个亚群的121个细胞样本,如表1所示。对数据的质量控制流程如图1A所示。作者观察到检测的基因数量与测序深度显著正相关(图1B)。而图1C展示了TOP的显著差异表达基因。在图1D中作者使用主成分分析划分细胞。图F展示了t-SNE的聚类结果。得到MAGs之后将得到的两类细胞的热图如图1G所示,在图1H中我们可以看到明显的转录异质性。

表1

图1

②在内部和外部ccRcc数据中对MAGs验证

作者首先整合44个差异hub MAGs的表达谱以及生存信息。使用LASSO筛选了17个预后相关基因(图2A,B)。样本对应的临床信息如表2所示。作者在两类中刻画了这17个预后相关的基因。接着使用多因素COX回归模型建立MAG特征。其AUC,ROC分别为0.763以及0.803。作者同时进行了生存分析以及外部数据验证。

表2

表3

图2

图3

③ MAGs和其他临床特征的相关性分析

作者为了探究MAGs在ccRCC中的临床意义,所以研究了MAGs与其他临床特征之间的潜在关系。Kruskal-Wallis检验显示,MAG评分升高与T分期增高(P = 7.586e-09)、淋巴结阳性率增高(P = 0.005)、晚期转移(P = 1.572e-06)、病理分期较差(P = 1.699e-08)和肿瘤进展分级(P = 1.643e-11)相关。此外,在TCGA-KIRC总队列中,MAG特征预测5年PFS较好,其AUC为0.752(图4F),并且通过log-rank检验证明MAG评分高的患者在肿瘤复发或进展方面具有更大的风险(图4G)。此外,作者在另一个ICGC数据集中验证了潜在的关系,发现MAG评分与T期(P =4.364e-04)和转移状态(P = 3.436e-05)显著相关。

图4

④ 构建预测进展的MAG nomogram

然后,作者将MAG信号与其他独立临床变量相结合,构建一个全面的ccRCC进展监测模型。排除了超过半数的缺失病例的N期因素,并且忽略了在多变量Cox回归模型中没有统计学意义的变量。最终选择了年龄、肿瘤分级、病理分期和MAG特征四个独立的风险特征作为模型(图5A)。利用广义线性模型(GLM)回归算法,开发了包含这四个特征的MAG nomogram,如图5B所示。根据MAG nomogram评分的中位数将TCGA-KIRC队列分为高分组和低分组。根据预测的1年或3年进展/复发事件与实际观察结果之间的一致性,绘制校准曲线来描述拟合模型(图5C)。MAG nomogram预测1年和3年进展结果的auc分别达到0.848和0.837(图5D)。生存分析也表明,MAG nomogram是ccRCC PFS的显著预测因子,P = 0(图5E)。

图 5

⑤ 两个nomogramm评分水平之间的体细胞突变负担差异

作者在TCGA-KIRC队列中定义并计算了TMB,并将其与相应的MAG nomogram评分进行匹配。此外,计算了分布在5%以上样本中的突变的差异突变率,经卡方检验发现,SETD2、BAP1和MTOR在高危组的突变数量明显多于低危组(图6A)。此外,Wilcoxon秩和检验表明,高TMB组的MAG nomogram风险评分显著高于低TMB组(P = 2.875e-05)。进一步分析了TMB在ccRCC中的生存意义,发现TMB水平越高,进展事件的风险越大,P = 0.01(图6C), OS结果越差,P = 0.035(图6D)。因此,推测高MAG nomogram评分的ccRCC患者存在较高的TMB水平,这也被证明是ccRCC的一个危险因素。

图6

⑥GSEA

选择517例ccRCC患者的转录组数据,以MAG nomogram评分作为参考表型,进行基因集富集分析(GSEA)。观察到,氧化磷酸化、Wnt信号通路、MAPK信号通路和肾细胞癌串扰在高危组中上调。低危组P53信号通路、系统性红斑狼疮、果糖代谢均下调(图7)。所有这些异常通路均富集为恶性肿瘤的标志。

图7

4. 结论:

本研究从单细胞测序数据入手,结合多种生物信息方法,筛选了基于scRNA-seq的标记基因,并在大量ccRCC样本中进行了验证。不仅描述了pRCC和mRCC的基因组特征和异质性,还发现了一些MAGs,为预测预后和发现抗转移药物提供了可能的帮助。

5. 参考文献

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