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总结常用分子互作实验

菜校长的36策让我们进入了科研的大门,老谈老师的24型让我们初次具体领略表型的标。临床医生做科研,本就比“专业选手”起步晚,基础科研还那么难,想要产出这个“时代的产物”就更难了。

而目前高分杂志对于文章的创新性和机制深度的要求越来越高,更是让我们望而生畏,今天就让我们来细数一下“直接机制”中的分子互作实验,希望对大家有点帮助。
蛋白质-蛋白质
1. 免疫沉淀(IP)
 
免疫沉淀是用于抗原检测和纯化的最广泛使用的方法之一。免疫沉淀(IP)的原理为:针对特定靶蛋白的抗体与样品(细胞裂解物等)中的靶蛋白形成免疫复合物,随后利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠将该免疫复合物从混合物中沉淀下来。
 
最后将靶蛋白从磁珠上洗脱(如果抗体没有共价连接到磁珠上或使用变性缓冲液进行洗脱,抗体也会被洗脱下来),并通过SDS-PAGE、Western Blot等手段对洗脱下来的蛋白进行分析。
 
2. 免疫共沉淀(co-IP)
 
Co-IP是免疫沉淀的延伸,主要用于蛋白-蛋白相互作用检测。Co-IP的原理是基于IP反应捕获和纯化靶蛋白,如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白,也会被一同捕获及纯化得到,随后利用SDS-PAGE、Western Blot等手段对得到的目标蛋白进行分析。
 
3. GST pull-down
 
将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽标记的磁珠上,作为与目的蛋白亲和的支撑物并充当一种“诱饵蛋白”。目的蛋白溶液与之孵育,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
 
最后说下co-IP和GST pull-down区别。co-IP研究的是体内自然状态下的蛋白质互相作用,反应的是比较真实的蛋白质相互作用,由于沉淀下来的是蛋白质复合物,不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的。GST pull down可以确定目的蛋白和检测蛋白是否发生直接相互作用,但是无法得知体内真实的结合情况。
蛋白质-RNA
1. RIP
 
用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,防止非特异性的RNA的结合,免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来,结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip)、定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。
 
2. RNA pull down
 
先将RNA进行标记(如生物素探针标记),再与细胞裂解液共同孵育,从而形成RNA-蛋白质复合物,之后再分离复合物得到蛋白质,通过western blot或mass spectrometry检测蛋白质的技术。
蛋白质-DNA
 
1. ChIP
 
在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
蛋白质-DNA/RNA
 
1. EMSA
 
主要基于蛋白-探针(DNA或RNA)复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针,当核酸探针与样本蛋白混合孵育时,样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物。
 
这种复合物由于分子量大,在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则较快;孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后,蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带,说明有蛋白与目标探针发生互作。
RNA-DNA
 
1. Luciferase
 
利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性,把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上游,构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性。可将海肾荧光素酶基因的质粒作为对照质粒。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
 
知道实验原理只是实验的第一小步,因为后面还有很多具体操作的“坑”等着你,但这个原理至少能帮我们避开几个“坑”。基础科研说到底还是个实践科学,需要动手来解决问题,实际操作之后才能真正“避雷”。

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    婚书网4天前 搜狗浏览器 Windows 7 回复

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