1. sci666首页
  2. 文献解读

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

miRNA是我们小张聊科研公众号介绍的非常多的一个方向,大家对miRNA也是非常熟悉的,一般来说,我们在做研究的时候会先选择一条文章里面没有报道过的miRNA分子,在研究完miRNA在疾病中的功能后,会通过Targetscan预测靶基因,然后通过WB和qPCR检测靶基因被miRNA调控的关系,最后再通过挽救实验和荧光素酶报告基因实验进行验证,这个基本上就是研究miRNA的“经典”套路,这个套路在10年前可以发在5分甚至10分以上的杂志上,现在文章要过5分已经比较难了。后来我们梳理了在“后经典套路”时代研究miRNA的新思路,其中说到miRNA本身的表达异常和miRNA的定位,今天我们要介绍的思路就与这两点有关。

今天的主角是这两篇文章:

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

 

第一篇是2017年12月份发表在NAR杂志上,第二篇是2012年发表在Cell Research杂志上,2012年Cell Research杂志的影响因子已经过10分了,这两篇文章的通讯作者都是曾科教授,研究的方向比较像,NAR这篇是miR-122调节miR-21的产生过程,CR这篇是miR-709调控共miR-15a/16-1的产生过程,两篇文章相隔5年,由此我们可以看到Cell Research这个杂志的文章质量了,也可以明白这个杂志突飞猛进的增长趋势:文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

如果大家对Cell Research感兴趣,可以看公众号介绍的这篇文章:如果股市像国内神刊Cell Research一样就好了!

好了,下面我们开始看文章的情况:

在介绍文章以前,我们先回顾一下miRNA的产生过程:

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

  • miRNA在转录过程与我们熟知的mRNA很像,从DNA转录出来的miRNA叫pri-miRNA,产生的pri-miRNA被Drosha酶处理后生成pre-miRNA,这个过程是在细胞核发生的;
  • 下面的过程是在细胞质里面发生的:pre-miRNA被Exportin 5蛋白转运出细胞核,进入细胞质,在这里pre-miRNA会进一步被DICER酶处理,产生两条成熟的miRNA(就是我们平时看到的5p和3p,所以我们知道一般情况下我们说某条miRNA的时候会有两条miRNA存在,比如miR-215就有miR-215-5p和miR-215-3p存在,而且两条miRNA的序列是不同的)。
  • 下面就是我们熟悉的miRNA作用模式了,miRNA通过与靶基因的mRNA结合抑制mRNA翻译或者导致mRNA降解,从而下调靶基因的表达。我们说的经典模式也就是这个步骤。

 

因此,与经典模式不同的是,两篇文章研究的是在第一步骤,其实第一步骤也包括两个部分:pri-miRNA的转录过程和pri-miRNA经过Drosha酶处理后生成pre-miRNA(转录后过程),其中第一个过程我们一般做组蛋白修饰、DNA甲基化和转录因子,两篇文章做的是转录后过程,即miR-122调节pri-miR-21到pre-miR-21和miR-709调节pri-miR-15a/16-1到pre-miR-15a/16-1的过程,因此我们说miR-122和miR-709分别从转录后调节miR-21和miR-15a/16-1的表达

 

下面我们简单看一下文章的思路,以NAR这篇为例:

(1)miR-122定位在细胞核里面。

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

蓝色的是DAPI染色,是染细胞核的,红色的是miR-122,我们可以看到miR-122在细胞核和细胞质里面都有。

说明:前面我们说pri-miRNA经过Drosha酶处理后生成pre-miRNA这个过程是在细胞核里面,因此第一步就要证明miR-122定位在细胞核里面。另外,我们知道成熟的miR-122是位于细胞质的,因此这里还有一个问题就是:miR-122是如何进入细胞核的,这个问题在文章讨论部分有提及,可能是Importin 8介导的(一个是Exportin导致pre-miRNA到细胞质,一个是Importin 8导致miRNA进入细胞核,是不是很有意思?)

 

(2)miR-122在肝癌细胞中表达降低,且抑制miR-21的产生。

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

这里检测的是miR-21产生过程中不同的前体序列和成熟序列的表达,我们可以看到pri-miR-21表达没有显著差异,而pre-mir-21和成熟体的miR-21表达显著异常。而且miR-122与miR-21的表达是负相关的:

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

 

(3)miR-122是通过结合pri-miR-21上序列,影响Drosha酶处理pri-miR-21下调miR-21表达。

具体的序列和位置是这样的:

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

我们看到红色的19个碱基的序列是黑色的miR-122的结合位置,为了证明两者的结合,作者还通过Pri-miR-21 pull-down assay来进行验证:

 

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

即:生物素(Biotin)标记Pri-miR-21的探针(反义序列),然后通过包裹了链霉亲和素(Streptavidin,能与Biotin结合)的磁珠来拉,这样就形成了miR-122/Pri-miR-21/Pri-miR-21探针/Streptavidin/Biotin的复合物,通过qPCR就可以可以检测miR-122了。

 

另外,为了证明Drosha在其中的作用,作者还用了Drasha的抗体进行免疫共沉淀实验来进一步证明,通过Northern Blot和qPCR来检测miRNA的表达:

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

 

(4)miR-122 对miR-21/PDCD4信号通路的调控及功能实验。

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

说明:PDCD4是miR-21 的靶基因,这里为了证明miR-122是通过miR-21来间接调节PDCD4,而不是直接调节PDCD4,用到了荧光素素酶报告基因实验。

文献解读:选miRNA作为miRNA的靶基因(新思路)

 

最后,我们挑一些词汇做介绍:

(1)putative:一般认定的,推定的,假定存在的。这个词汇在SCI文章中出现频率很高,大家可以作为常用词汇。文章例句:

To explore the mechanism underneath the blockade of miR-21 biogenesis by nuclear miR-122, we used RNAhybrid to analyze the potential cognate element on pri-miR-21 for miR-122, and identifed a putative binding site for miR-122 on human pri-miR-21. 

(2)ectopic :异位的,异常的。这也是一个SCI文章中的高频词汇,特别是我们在做描述过表达的时候。文章例句:

As shown in Figure 7A, ectopic expression of miR-122 induced the upregulation of PDCD4 in Huh-7 cells and this effect of miR-122 was abolished by co-expression with miR-21, suggesting that miR-122 overexpression may affect the miR-21/PDCD signal pathway. 

(3)abolish:消灭; 撤销; 废除,废止; 取消,革除。同样的,高频词汇,常用语挽救实验。文章例句:

  • As shown in Figure 7A, ectopic expression of miR-122 induced the upregulation of PDCD4 in Huh-7 cells and this effect of miR-122 was abolished by co-expression with miR-21, suggesting that miR-122 overexpression may affect the miR-21/PDCD signal pathway(NAR文章). 
  • Importantly, co-expression of miR-16 and miR-709 in L929 cells effectively abolished miR-709-induced Bcl-2 upregulation, suggesting that Bcl-2 upregulation induced by miR-709 occurred through the downregulation of cellular miR-16.(Cell Research 文章)
①SCI666交流QQ群:医学综合科研群:703163967 · 生信分析群:732179952 · Meta分析群:797345521(点击群号即可加群)。
②下载提示:点击查看百度网盘会员共享账号,部分内容具有时效性,若文中的下载链接失效请留言反馈。

发表评论

登录后才能评论

联系我们

(857)626-2666

在线咨询:点击这里给我发消息

邮件:123456@whu.edu.cn

QR code