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常见研究DNA与蛋白质相互作用的经典方法

在生物生命活动中,蛋白质发挥着至关重要的作用,许多生命活动都是以蛋白质为核心进行相互作用。其中,蛋白质与DNA相互作用十分重要。蛋白质像一把钥匙,可以将DNA锁打开,从而影响转录调控。今天我就为大家整理了几个研究DNA与蛋白质相互作用的经典研究方法,如果有需要的同志可以多多了解一下。

凝胶迁移实验EMSA

一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)可以:

1. 研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用;

2. 可用于DNA定性和定量分析;用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

实验操作视频链接:https://www.jove.com/science-education/5694/electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

足迹实验

蛋白质结合在DNA片段上,能保护结合部位不被DNase破坏,DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”),进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上,相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。DNaseI足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法,它不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白,而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。足迹试验的方法较多,常用的有DNaseI足迹试验和硫酸二甲酯足迹试验(dimethylsulfate,DMS),两者原理基本相同。

 

甲基化干扰实验

原理:DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供甲基基团,在DNA 甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)的作用下,将CpG 二核苷酸的胞嘧啶(C)甲基化为5-甲基化胞嘧啶(5-mC)的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。而本实验根据DMS (硫酸二甲酯)能够使DNA中裸露的鸟嘌呤残基甲基化而六氢吡啶又会对甲基化的鸟嘌呤残基做特异性的化学切割这一原理设计的一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。

荧光素酶报告实验

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性,把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因(firefly luciferase)的上游,构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

实验视频操作链接:

https://www.jove.com/video/3343/identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

 

 

染色质免疫共沉淀技术ChIP

在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。可以利用ChIP研究转录因子( transcriptionfactor,TF)与启动子(promoter)的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当TF与Promoter相互结合(生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近,或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。

 

 

实验视频操作链接:

https://www.jove.com/video/56186/chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol-for-low-abundance

 

 

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