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转染方法的选择以及转染技术的注意事项

转染可谓是做生物学实验的大家经常会考虑的一项实验技术,大致原理也都是明白的。实验室的师妹也一直在进行这个实验,最近她却一直愁眉苦脸,问了才知道,原来她转染完的细胞,去跑qpcr验证的结果一直不行,转染效率太低以至于无法进行后续的实验。到底转染是什么呢,为什么转染效率不高呢,今天我们就来一起讨论一下其中奥妙吧。
转染,就是在真核细胞里导入具有生物功能的核酸,并在细胞中维持其生物功能。
转染方法的选择
我们熟知且常用的转染方法主要有物理介导,化学介导,生物介导。但实验室使用较多的主要有化学介导中的脂质体转染(质粒转染)和生物介导中的慢病毒转染法。其中质粒转染操作简单,一般瞬时转染选择较多,但有些细胞系不容易转染,因此选择转染方式时一定要做足功课,亲身经历告诉我,千万不要图方便,否则转染效率简直崩溃。特别是养原代细胞的小伙伴,一点要认真选择!病毒转染一般具有能够稳定表达的优势,且其对原代细胞有较高的转染效率,其中更分为慢病毒转染,逆转录病毒转染和腺病毒转染,其中腺病毒转染可适合更为难转染的细胞,例如悬浮细胞、T细胞、raw细胞等难转染细胞。
转染技术的注意事项
1、细胞状态
众所周知,细胞的生长状态影响实验结果,原代细胞和传代次数多的细胞都不是最佳选择,处于对数生长期的细胞生长状态最好,最适合转染。同时,我们都知道细胞的密度不宜过大,大家往往注意的都是转染前的密度,失败过很多次的经历告诉大家,转染后的细胞密度更加重要。有时候转染时间太久,等到进行后续实验时细胞已经肆意生长,漂起来了,岂不前功尽弃,流着眼泪也要告诉大家,考虑好细胞的生长周期和转染的时间进行铺板,建议选择50%~80%区间密度进行细胞转染。

(图片来自网络)

 
2、实验污染
跟细胞有关的实验当然要注意不能污染啦,细菌,真菌,支原体都是应该严格注意的,不仅会浪费试剂,也会影响实验结果。(注:支原体污染不易观察到,转染前可用环丙沙星处理避免污染)
 
3、转染试剂的处理
质粒转染:1. 质粒的纯度会影响转染的效率,如果质粒不纯,其含有少量的盐,蛋白会严重影响转染复合体的形成,因为内毒素严重影响转染效率,还需进行质粒内毒素的处理。
2. 其次如选用lipo2000或lipo3000,需注意严格按照说明书的加样顺序添加,其中mix well只需用枪轻轻混匀或手指轻轻晃动,切忌用力吹打,会导致脂质体失去作用。
3. 质粒转染时需用无血清的Opti-MEM Medium,关于是否严格控制双抗,最好咨询一下转染试剂厂家技术,本实验室用的lipo3000咨询过技术支持,说使用双抗并不影响转染效率,害怕污染的小伙伴们可以放心使用啦。
稳转株的筛选
根据不同的实验需求,如需进行划痕,transwell等培养时间较长的实验,最好使用稳转细胞株而我的实验最后收细胞只需检测相应蛋白的表达不用较长时间培养,选择瞬转即可。质粒转染一般是瞬时转染,如需筛选稳定株需要在药物的作用下,因常用质粒载体pcDNA3.1,其含有neomycin的基因,可选择G418进行筛选,根据教程需要提前对不同浓度的G418进行细胞筛选,选择最适筛选浓度,提供一个小tip!可以通过阅读文献,选择一定的浓度区间大梯度进行筛选,在全部存活和死亡较多的两个浓度间再设定浓度梯度进行筛选,这样得出的筛选浓度更为准确。同时由于基因转染进入细胞内需要一定时间才能够表达出相应的蛋白质,但如果转染时间较长,细胞代谢时间较久,转染细胞也会逐渐减少,因此要合理控制进行筛选的时间。注意:药物筛选时细胞密度不要太低,否则密度太低全部筛死就可以快乐地进行下一次实验了。
转染效率的验证
1、最有效的验证方式必须是qPCR验证
2、荧光观察,使用病毒转染,明白自己病毒的情况,是荧光标记(一般是GFP)还是非荧光标记。质粒转染,可以在载体上添加荧光标记,帮助自己通过荧光观察转染效率。但是荧光并不能完全证明转染效率,还是通过核酸验证最为准确。
细胞转染并不困难,了解实验的原理之后,操作起来就得心应手啦。但有时候实验就是一门玄学,其中奥妙也是一言难尽,希望大家在实验中都能更多的感受到实验带来的乐趣,实验虐我千百遍,我待实验如初恋!诸君,加油!

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