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研究miRNA的完美技术路线(研究套路)

想必大家都要做实验课题设计,例如在写开题或者标书的时候,也就是计划要在接下来要做的实验,咱们上一期给大家介绍了lncRNA的研究是如何规划课题设计的,讲解了一篇10分文章的lncRNA文章研究套路。
今天咱们来讲一讲万金油miRNA的技术路线设计套路,不要只知道荧光素酶报告实验哦。
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
 
一般来讲,咱们研究miRNA的功能和机制都是关注其降解调控靶基因mRNA的丰度水平的,例如miR-X靶向调控Y基因的mRNA水平,有哪些技术路线呢?
 
(1)确定配对关系
最基本的就是调控关系是这种碱基配对序列,你在targetscan、miRanda等网站上预测的miRNAs多达上百个,需要进一步验证他们的匹配性和作用位点。
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
选打分高的miRNA
 
(2)确定表达相关性
一般来讲,如果miRNA靶向结合mRNA的3’UTR区,起到降解mRNA作用的,那么miRNA和mRNA的表达水平是负相关的,就是miRNA↑→mRNA↓,miRNA↓→mRNA↑,这里需要给一张图用来证明。
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
miRNA和mRNA的关系是这样的(3’UTR区结合)。
 
可以到数据库上去预测配对关系、下载。
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)

或者自己检测样本或者细胞中两者表达情况绘制关系图
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
 
(3)细胞实验:miR-X对靶基因呈现梯度抑制现象
体外细胞实验咱们用到miRNA mimics,这是模拟生物体内源的miRNAs,运用化学合成的方法合成,能增强内源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。
 
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
Mimics和miRNA inhibitors示意图

最经典的验证方式还是检测时间依赖和浓度依赖,一般采取浓度依赖检测就足以。
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
设置了mimics的浓度梯度之后,可以做WB验证蛋白的表达水平,也可以直接做Q-PCR验证mRNA水平。
 
这一步的实验设计是为了证明miR-X对于Y的上下游调控关系以及表达负相关性,以及确定miRNA mimics的最佳使用浓度。
 
(4)miR-X对靶基因mRNA调控的物理结合验证
这一步呢要使用RIP和RNA-pulldown,但是感觉好贵呢,小小的miRNA实验都要花这么多钱,如果有钱呢,就设计进去,钱不多就省略掉好了,反正后面还有其他实验可以支撑。
 
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
用RISC复合物的抗体做RIP,以及RNA pulldown,拿到纯化的RNA做个Q-PCR
这样可以验证物理上miRNA和mRNA是结合的。
 
(5)miR-X对靶基因mRNA调控的功能性验证
这里的就是用荧光素酶报告实验(luciferase reporter assay)
在荧光素酶报告基因载体的报告基因编码区的下游插入ncRNA或者mRNA的3’UTR区,然后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平,通过检测荧光素酶的表达情况以分析ncRNA或者mRNA的3’UTR区中是否含有miRNA的靶位点。同理任意两种RNA-RNA互作都可以利用这个原理。
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
把靶标基因的3’ UTR克隆到luciferase载体上,荧光强度与miRNA mimics的浓度成反比
 
(6)seed region序列的阻断实验:anti-miR、3’UTR突变
前面讲的实验都是基于miRNA和mRNA的互补结合序列,那么接下来可以设计阻断实验进行验证其互作,阻断实验有两种:
①阻断miRNA的结合
这里用到miRNA的inhibitors,例如miR-X的反义RNA寡聚物anti-miR,其能阻断miR-X RISC复合物对靶基因mRNA的降解。
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)
阻断miR后,基因的表达不再被抑制

②突变mRNA的3’ UTR的seed region
就是制作mRNA 3’ UTR的seed region的突变株,或者构建靶基因过表达载体,将3’ UTR的seed region突变,使得miR-X无法结合。
 
研究miRNA的完美技术路线(研究套路)

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