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Western blot实验过程中可能会出现的问题

Western blot作为蛋白定量的一种方法,在实验室具有不可动摇的地位。基础实验中,几乎每篇文章都会有western blot的图,但是western blot历时时间长,每一步都有可能出错,笔者和身边的小伙伴觉得我们的经验踩过的坑都可以写一本书了。今天就探讨一下实验中可能会出现的问题,大家引以为戒。

 

蛋白定量

蛋白定量注意两点:

第一、BSA浓度要从5mg/ml配到1mg/ml或者2mg/ml,如果你做蛋白定量每次你的蛋白都低于最小值,那很有可能就是BSA浓度没有稀释,导致最后的蛋白浓度肯定是会小于最小值的。我曾经一天做过三次BCA,都小于最小值,都快怀疑人生的时候,才想起来可能是这个原因,最后试了一下果然是的。

 

②超声的时候,因为超声发热损伤蛋白,我们一般会把要超声的样本放到冰水混合物里,如果超声的时候有冰块掉进去的话,也会导致蛋白浓度过低。

 

③收取细胞的时候,一般是用PBS冲两遍,如果PBS没有吸干净,可能也会导致蛋白浓度过低。

 

第二、煮蛋白的时候一定要将盖子扣紧,最好还是用进口的EP管,不然的话EP管崩掉就惨兮兮了(我眼睁睁看着它在我眼前崩开)就没有定量的意义了。

 

Tips:有很多课题组会不进行蛋白定量,会用Image J 做个蛋白定量条形图的分析,发过文章的人都知道,western的定量图都很大程度上有主观意识在里面,你可以自行删减一些比较跳的数据,所以我建议还是提前做定量,最后也可以省时省力。

 

正式开始跑胶

配胶

1、夏季配胶注意温度的影响,在灌了浓缩胶之后要立即插上梳子,否则上层胶如果快要凝固,就算最后拔完梳子,上样的时候多半也会飘。如果是冬天,可以把胶放到37℃孵箱里,那样可以节省胶凝固的时间。

 

2、梳子注意匹配好1.5mm的和1mm的板子,1.5mm的多半也插不进去1mm的,但是如果1mm的梳子插到了1.5mm的梳子里面,由于中间有空隙,就会有胶凝固在里面,上样一定会飘。

 

3、然后就是胶的浓度:

80~140kd的多用8%

25~80kd的用10%

15~40kd的用12%

20kd的用15%

 

上样

1上样一定注意不要配错buffer!上样一定注意不要配错buffer!上样一定注意不要配错buffer!(重要的事情要说三遍)之前有个师弟帮一个师姐配胶,把SDS的浓度搞错了,导致师姐的胶跑出来marker是异常分开的,浪费了样本,师姐过来看的时候是崩溃的。

 

2、还有就是电泳槽的内槽,上完样以后记得加满buffer不然的话,蛋白跑到一半的时候就会停住不跑了。因为running buffer里面有一些离子是起着类似于导电的作用,如果水加不满,就可能会导致不通电,它就会停住不跑了。

3不要暴力拔梳子,上层胶凝了一会就可以泡到running buffer里,不然可能会导致梳子不太好拔,如果暴力拔梳子,会导致板子裂掉。(别问我为什么知道)

 

转膜

转膜可讲的就太多了,我可是一个在转膜上兜了半个学期的loser,多谢师姐不弃,拉我出坑。

1、buffer一定要配的对,并且还要敏锐地感觉到自己有没有倒错buffer(这句话看起来有点傻),但是我记得我有一次倒完buffer以后赶气泡的时候,怎么赶气泡都赶不完,后来一看,傻掉了,倒成了running buffer,因为我当时想起来,可能是SDS产生的泡沫,但是transfer buffer里面是没有SDS的,是不可能有气泡的。

2、转膜的时候一定要夹紧夹子,虽然是3+3的滤纸海绵结构,但是宁愿紧一点,不要松一点,松一点极有可能是转不上的。可以增加海绵的厚度,也可以多加两块海绵,但是多加滤纸的时候要小心,因为由于滤纸的质地和材质不一样,可能会导致滤纸的电阻比较大,需要延长转膜时间才可以,这个还是需要前期摸索的,在增加滤纸之前记得去网上查一下,不要盲目自信。(自然也是吃过亏的)

3、夹三明治结构的时候可以多加水,没过膜和胶,这样有助于减少气泡。

4、注意转膜温度的控制,可以提前将transfer buffer放到4度冰箱,等用的时候取出来,就会像冰镇西瓜一样,冰到你心里,然后外围再加冰水混合物,如果觉得天气太热冰容易融化的话,还可以放两个冻好的冰袋,一般这样就可以保证转膜的时候不会烧膜,万无一失。

5、转膜液配置的时候,甲醇浓度20%

6、转膜的时候,海绵要比滤纸大,滤纸要比胶大,PVDF膜或者NC膜,要比胶大。但是大小不要超过海绵。

 

封闭

我们常用的是5%的脱脂奶粉,但是如果你做的蛋白不太好做,也可以尝试用BSA封闭。

 

孵育一抗二抗

1、这个没有过多的说的,但是建议孵育抗体之前看一下说明书,这个抗体建议的稀释比,以及抗体的种属来源,尤其是帮师兄师姐干活的时候,不太清楚的抗体一定记得查说明书,western一共做下来,这么久了,在孵育抗体的时候出错的话,师兄师姐多半也会崩溃的。

 

2、蛋白表达量少不太好做的话可以尝试用5%的牛奶稀释抗体,或者用5%的血清稀释抗体。

 

3、孵育一抗的盒子一定记得洗干净,因为会有其他抗体的残留,从而导致你的条带会出现干扰条带。

 

显影

1、显影液虽然有点贵,但是该用还是得用,如果你的膜是这样的:

那么很有可能就是显影液没有覆盖到你膜上的有些地方。

2、曝光内参的时候,如果显影液是超敏的,可以考虑稀释一下,然后曝膜的时候从毫秒开始起曝,不然过曝了就没有意义了。

 

碎碎念:

1、一般western的内参会洗膜以后再去孵育内参的抗体,这样比较可信。

 

2、如果你的蛋白条带相差比较大,还可以把膜剪开,分开孵育抗体,多的甚至有剪三条的,在同一张膜上分开孵育也更具有说服力。

 

3、内参比较灵敏,有时候会连成一条线,这个时候可以尝试减少上样量,我做细胞的话,一般每孔上样20ug就可以了,内参跑出来还可以。

 

最远的套路莫过于western的套路,尝试去了解实验背后的原理,就可以知道自己所做的每一步是否还有挽救的余地,每个实验都是如此,致自己,也给你们,希望你们可以跑出漂亮的条带!

 

封面图来源于网络

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