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通过Quickchange设计基因定点突变引物

基因定点突变:为了研究某一基因的功能,我们通常不仅需要研究其野生型基因的功能,也需要进一步去挖掘它发挥作用时是哪一个结构域,甚至是哪一个氨基酸发挥了作用。而这里面就涉及到了如何设计定点突变引物的问题,今天为大家介绍一个在线网址quickchange primer design,可以非常方便快捷为我们设计出合适的引物。
 
你可以直接百度搜索quickchange或者输入https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp就可以进入到该网站的主页面。

该网站可以设计单点和多点突变引物以及删除或者插入一段DNA序列 插入时只能插入小的DNA片段)。我们今天着重讲解如何利用该网站设计引物,并利用该引物构建出我们想要的突变体。

如果我们实验室又穷,又不想买突变试剂盒怎么办?我们可以不用管第2步,默认其设置,不用试剂盒也可以构建出我们想要的突变体。
 
3个选项输入我们的DNA序列,既可以通过Browse选项上传已经下载好的序列,也可以直接粘贴文本格式或FASTA格式的DNA序列。第4步将DNA序列转换成蛋白序列Upload Translated。下面我们以人的TP53基因为例进行演示:
 
首先我们从NCBI上下载TP53基因序列,将其粘贴到相应选项框内,并转换为氨基酸序列,如下图:

同时我们也会看到多出来的选项5,如果我们要进行点突变,则需要勾选5后面的灰色圆圈

在下面这个框选中我们要突变的目的氨基酸,如红色圆圈标出所示:

同时在下面选框勾选出我们想要突变成的氨基酸,这个就表示我们将N29突变为IN29I),S33突变为K (S33K)L35突变为E (L35E)E55突变为C (E55C)

该网站可以同时设计针对7个氨基酸的突变引物,接下来点击Primer Design即可得到引物序列:

 

同时也能看到对应引物的长度及其相应的Tm值:
 
也能看到引物与模板相互匹配的序列:

接下来我们再讲如何删掉一段DNA序列,同样我们选择or下面的小圆框,选中两个氨基酸,即可设计出删掉这两个氨基酸之间片段的引物(注意:这两个氨基酸不会被删除)。

比如我们想删掉第29个氨基酸和第51个氨基酸之间的片段,我们可选中29N51E即可,如下图

依旧点击Primer Design即可设计出引物,且能看到引物与模板之间的配对情况。

好了,是不是感觉定点突变的引物设计很简单呢?接下来,我们拿到引物就可以进行突变体构建了。
 
1.如下是我的PCR反应体系:
Template:  200ng (XμL)
Forward primer:1μL
Reverse primer:1μL
5*reaction buffer:10μL
2.5mmdNTPs:4μL
Pfu DNA polymerase:1μL
Nuclease-free water:up to 50 μL
 
2. 然后就按照你所买的DNA高保真酶(PCR Enzyme)的说明书设置PCR反应条件,我一般设置30个循环
 
3. PCR反应结束后,直接加入Dpn I 限制性内切酶(待突变的质粒在细菌中会被甲基化修饰,因此,用Dpn I可以消化掉相应的模板质粒,而使突变质粒保留下来)及相应的buffer37℃酶切反应1h左右(也可相应的缩短或延长酶切反应时间)
 
4.直接用DNA回收试剂盒进行胶回收,根据浓度,取100ng进行转化,涂平板。
 
5. 第二天即可挑取单菌落送测序。
 
6.随后将测序正确的样品提质粒,即可进行后续相关实验。
 
有没有觉得点突变很简单呢?如果你正在进行相关实验,不妨试一试。
注:个人经验,一般单点突变成功率较高,可达100%。在进行多点突变时可将多对引物放在一个PCR反应体系中进行,但相应的效率也会降低。笔者做过同时突变两个点和四个点,将突变引物全部加到一个体系中,阳性率在25%~60%之间不等。

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