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2019年国自然两个热点研究方向(m6A、lncRNA)

最近放榜的国自然项目中,表观遗传组最耀眼的当属m6A了。从2015-2019年呈现逐年递增的趋势,从去年的55项倍数增长至至少135项。

 

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Pubmed上关于N6-methyladenosine或m6A等关键词搜索在2019年至今共214篇文章。

 

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同时在去年大火的lncRNA项目中,今年有475项立项,有直追老大哥micro RNA的趋势。

 

在大家都担心热点人人都追,而自己只能做炮灰的时候,已经有人开始将热点集中研究,在热点中创造新意。接下来这篇文章就完美结合了lncRNA和m6A两大热点。着这篇名为m6A-induced lncRNA RP11 triggers the dissemination of colorectal cancer cells via upregulation of Zeb1的文章发表在10分的Molecular Cancer上。让我们一起来梳理一下这篇文章思路。

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1.表型研究——RP11在结直肠癌细胞和组织中上调

 

首先作者使用微阵列分析了正常和结直肠癌组织对中lncRNA RP11 的升高,qRT-PCR也高度富集。随后比较了32名个体患者结直肠癌组织中有30个RP11表达显著增加。TCGA数据证实RP11在结肠癌和直肠癌中的表达显著大于相邻正常组织,并且RP11在多种结肠癌细胞系相对较高。结论:在结直肠癌细胞和组织中lncRNA RP11增加。

 

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2.细胞表型,动物实验——RP11在体外和体内都会引发结直肠癌细胞的扩散

 

在HCT-15、HCT-8、DLD1、SW480和RKO细胞中过表达RP11(RP11低表达细胞)。作者利用划痕实验和Transwell实验证实RP11能增加HCT-15细胞的体外迁移和侵袭。过表达RP11的结直肠癌细胞呈现梭形成纤维细胞的外观提示RP11可能调节上皮间质转化和癌症转移。体内实验进行了裸鼠RP11-过表达HCT-15肿瘤异种移植,进一步确定RP11对体内转移的影响。结论:RP11能促进结直肠癌细胞的体外和体内传播并诱导上皮间质转化。

 

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3.下游机制研究——Zb1的上调介导RP11诱导的结直肠癌细胞的扩散

 

接下来作者分析出RP11过表达增加了HCT-15和HCT-8细胞中上皮间质转化因子Zb1的表达,而敲降RP11下调了细胞中Zb1的表达。RP11过表增加了肿瘤异种移植物中Zb1的表达。蛋白质印迹分析证实,Zb1敲除减弱RP11诱导的FN上调和E-Cad下调。结论:Zb1的翻译后上调参与RP11诱导的结直肠癌细胞的传播。

 

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4.下游机制研究——Siah1和Fbxo45的下调介导RP11诱导的Zb1的上调

 

作者利用免疫沉淀和质谱分析表明RP11诱导的Zb1上调不是由于直接相互作用。之后检测了泛素-蛋白酶体系统中7个报道因子的基因表达水平,表明RP11过表达显著降低了Siah1和Fbxo45的表达水平,western实验证实。RP11过表降低肿瘤移植物中Siah1和Fbxo45的表达。Siah1和Fbxo45的过表达减弱了RP11诱导的HCT-15细胞中Zb1的上调。然而,RP11质谱分析没有显示HCT-15细胞中RP11与Siah1或Fbxo45之间的结合。结论:RP11下调Siah1和Fbxo45的基因水平,但不与Siah1或Fbxo45蛋白结合。

 

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5.下游机制研究——RP11通过形成RP11-hnRNPA2B1-mRNA复合物来调节Siah1和Fbxo45的表达

 

RNA pull-down和RIP实验表明 RP11与hnRNPA2B是直接相互作用的蛋白质。RIP-PCR显示,在 RP11过表细胞中,hnRNPA2B1与Siah1和Fbxo45的mRNA的结合十分显著。结论:RP11通过形成RP11-hnRNPA2B1-mRNA复合物来调节Siah1和Fbxo45的表达。

 

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6.上游机制研究——m6a修饰参与结直肠癌细胞RP11的上调

 

m6A RNA RIP q-PCR显示RP11过表细胞系的m6A抗体水平高度富集,且m6A甲基转移酶mettl3的过度表达,同时m6A的脱甲基化酶alkbh5的过表达降低了rp11的表达。同时mettl3过表达增加了hct-15和hct-8细胞中RP11与hnRNPA2B之间的结合,表明m6A积极调节细胞中RP11的表达。结论:6a修饰可以通过增加RP11核积累来增加结直肠癌细胞中RP11的表达。

 

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7.临床表型——m6A/RP11/Zb1轴与结直肠癌的体内进展

 

在结直肠癌组织中,METTL3和Zb1的表达呈上升趋势,恶性转化过程中逐渐升高,Fbxo45的表达呈下降趋势,证实了m6A能调节RP11的表达,进一步,RP11调节Siah1-Fbxo45/Zeb1参与了结直肠癌的发生。随后利用生存曲线表明个基因在结直肠癌中与生存预后的关系。结论:结果表明m6A/RP11/Zb1轴触发结直肠癌在体内增殖。

 

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整体研究思路:

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